Summary
Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.
Abstract
Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yüzlerce, binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçiren bu hastaların 1 yaklaşık üçte biri, hastalığın ilerlemesi ya da bir önceki hasat nedeniyle uygun otolog donör damarları zorunda değilsiniz . Vasküler doku mühendisliği amacı bu bypass greft için uygun bir alternatif kaynak geliştirmek için. Buna ek olarak, vasküler doku mühendisliği, kardiyovasküler hastalıklar çalışmada vasküler modelleri yaşayan gibi değerli ispat edebilir. Hücre tabanlı yöntemler geliştirilmesi ve analizi odaklanan pek çok yeni çalışmalar ile mühendislik kan damarları için bazı umut verici yaklaşımlar incelenmiştir 2-5 Burada, biz hızla kullanılabilir 3D doku halkalar şeklinde kendini monte hücreleri için bir yöntem in vitro vasküler dokuların modeli.
Bunu yapmak için, düz kas hücrelerinin süspansiyonlar yuvarlak dipli halkalı agaroz kuyulara numaralı seribaşı. Agaroz yapışkan olmayan özellikleri inci izine hücreleri uyumlu bir doku halkası oluşturmak için kuyunun merkezinde bir yazı, agrega ve sözleşme yerleşmek için 6,7 Bu halkalar, mekanik, fizyolojik, biyokimyasal ve histolojik inceleme için hasat önce birkaç gün süreyle kültüre olabilir . Biz bu hücre kökenli doku halkaları benzer süreleri (<30 kPa) kültüre diğer doku mühendisliği vasküler yapıları için bildirilen değeri aşıyor 100-500 kPa nihai çekme dayanımı 8 verim olduğunu göstermiştir. 9,10 sonuçları bu sağlam hücre göstermektedir kısa bir süre içinde elde edilen damar dokusu halka nesil ve hücreleri ve vasküler doku yapısı ve işlevi hücre kaynaklı matriks (CDM) katkılarıyla doğrudan ve kantitatif değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.
Protocol
1. Hücre tohumlama kalıp imalat
2 mm bir merkez sonrası çapı 15, yuvarlak tabanlı, anüler kuyuları oluşturmak için polikarbonat 1 / 2 "kalın parça öğütülmesi ile başlayın. Öğütülmüş kanal 6 derin mm ve 3,75 mm geniş. Temizlik ve polikarbonat kalıp kuru. öğütme işlemi herhangi bir plastik pislikleri temizleyin.
Mix polidimetilsiloksan tüm hava kabarcıkları ve polikarbonat kalıp üzerine dökmek için kür ajanı, gazını tabanının 10:1 oranını (w / w) (PDMS). Degas, herhangi bir kalan kabarcıklar tekrar kaldırmak ve 60 ° C'de 4 saat boyunca fırında tedavi.
Kürünü polikarbonat yavaş yavaş soyma tarafından dikkatle PDMS şablonu kaldırmak, su ve sabun ile yıkayın ve otoklav. Ayrıca iki yüzde agaroz (w / v) Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) içinde çözünmüş bir çözüm otoklavda.
PDMS şablonu, düz bir yüzeye yerleştirin ve erimiş aga ile doldurun. merkezi yazılan kalıp her birine ilk pipetleme agaroz yükseldi ve daha sonra etrafındaki uzaya pipetleme. Agaroz (yaklaşık 15 dakika) sağlamlaştırmak için izin ver, sonra PDMS agaroz serbest kalıp ters çevirin. Kuyuların her biri dört bir yanından gelen aşırı agaroz Kes ve agaroz kuyulardan 12 kuyucuğu içine yerleştirin.
2. Hücre kültürü ve halka tohumlama
Kalıp üst kapsayan, agaroz kalıp dış çevresindeki hücre kültür ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile DMEM) ekleyin. Inkübatör tabak yerleştirin ve hücreleri hazırlamak için yaklaşık 15 dakika denge sağlaması için izin verir.
% 90 izdiham, sıçan aort düz kas hücreleri (rSMCs) trypsinize ve 5x10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon tekrar süspansiyon. Anüler agaroz kuyuların her birine hücre süspansiyonu her bir kuyunun hücreleri uygulamak için bir dairesel hareket kullanarak Pipet 100 mcL.
içerik "> emin inkübatör raflar düzeyde olduğundan emin olun, sonra inkübatör tabak yerleştirin ve onları 24 saat boyunca rahatsız edilmeden oturmak için izin Exchange orta, her iki gün sonra iyi dört bir yanından gelen medya aspire, ve yeniden doldurma her bir kuyunun kadar agaroz tamamen sular altında.3. Doku halka toplama ve kalınlık ölçümleri
Bitiminde kültür merkezi yazılan üstünden kaydırarak agaroz kalıp halka çıkarın.
Fosfat ile küçük bir Petri kabındaki halka koyun salin (PBS), merkez örnek tamponlu ve bir dijital görüntüleme sistemi kullanılarak bir görüntü elde.
Kenar algılama için bir görüntü analiz programı kullanın ve çevresi yaklaşık 4 pozisyonları (üst, alt, sol ve sağ) halka kalınlığı ölçmek. Her bir halka için ortalama kalınlığı (t) değeri hesaplayın ve kesit alanı hesaplamak için bu değeri kullanın(2π (t / 2) 2).
4. Yüzük Mekanik test
Yatay konumda çekme test makinesi (Instron EPS 1000) ayarlayın. 1N ± 1dk yük hücresi ve özel ince tel sardı (paslanmaz çelik tel bükme tarafından oluşturulan) takın.
Iki ince tel kulpları halka örnek monte edin. Kancalar 5 mN dara yükü örnek uygulanana kadar uzatın. Kesit alanı (kalınlığı ölçümleri hesaplanan) girin ve ölçü uzunluğu kaydetmek.
Ön döngüsü 10 mm / dak hızında dara yükü ve 50 kPa stres arasında 8 kez çalar. Sekizinci ön döngüsü sonra, 10 mm / dak 'da başarısızlığa çekin. Başarısızlık,% 40 oranında bir ölçüm sonraki yürürlüğe bir azalma olduğunu kaydetti. Her bir halka örnek için, nihai çekme gerilimi (UTS) ve başarısızlık gerginlik ölçmek ve elde edilen veriler maksimum Tanjant modülü (MTM) hesaplamak.
5. Doku halka olaraksembly doku tüpler imal
Özel palplanşların yuvarlak dikdörtgen kesikler (2 cm x 3 cm) 5 cm polikarbonat diskler işlenmiştir. Bu disk ile birlikte iki sahipleri vidalı izin vermek için dişli delikler delin. Özel tüp sahipleri Otoklav ve ardından biyogüvenlik kabini ve boş bir Petri kabı yerine transfer.
1.9 mm çapında silikon tüplerin uçları Eğimli kenarları oluşturmak için bir açıyla kesmek ve sonra silikon tüpler otoklavda cerrahi makas kullanın. Tüpler otoklava edilirken, medya ile bir Petri kabı doldurun.
Agaroz kuyulardan halkalar çıkarın ve medya ile Petri kabı koyun. Yeri kullanmadan önce ıslak aynı Petri kabındaki silikon tüpler otoklava.
Bir silikon tüp kesik ucunu, bir halkanın merkezi içine yerleştirin ve hafifçe silikon tüp üzerine halka slayt forseps kullanın. Ri, istediğiniz numarayı tekrarlayınNGS. Birbiri ile temas halkaları hafifçe tüp boyunca her iki yönde de gittikçe onları iterek kaydırın. Bu yöntem, kültür sadece bir gün sonra hasat halkaları için kullanılabilir.
Bir kez yüzük polikarbonat sahipleri içinde silikon tüpler hizalamak ve sahibinin iki parça birbirine vida monte edilir. 100 mm Petri kabındaki sahibi yerleştirin ve 55 ml medya ekleyebilirsiniz. Exchange medya her kültür süresi 3 gün.
Doku tüpleri kaldırmak için, polikarbonat sahibinden silikon tüpler bırakın ve silikon tüp kapalı ve PBS ile dolu bir Petri kabı içine doku tüpleri slayt forseps kullanmak.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Protokolü doğru yapıldığında, hücrelerin iç çapı ile ilgili kalıp sonrası 24 saat içinde çapına eşit bir doku halkaları oluşturmak için agrega. Halka kenarlar genellikle görünüş olarak düzgün ve (eğer kültüred), düz bir yüzey üzerinde tüm çevresi kalınlığı tekdüze. Doku çaldığında kolay ve daha sonraki mekanik ve histolojik analiz için kuyu (Gwyther et al, 2011 8) çıkarılabilir. Doku halka morfoloji, matris kompozisyon ve mekanik özellikler numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı ve türüne göre değişir.
, Hücre tipleri, değişen koşulları tohumlama ve kültür süresini doku halkaları Temsilcisi sonuçlar Tablo 1'de gösterilmiştir. 5x10 5 rSMCs oluşturulan iki mm ID halkaları, bizim daha önce yayınlanmış 2 mm halkalar (6.6x10 5 rSMCs yapılan) oluşturulmuş bir yüzük daha yüksek UTS sergiledi. Sıçan hücreleri, insan düz kas hücreleri (HSMC) 8 kolayca doku oluşturmak için toplanmış kültürde sadece 14 gün (veriler gösterilmemiştir) sonra büyük miktarda kolajen içeren halkaları. İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) toplanmış ve birbirine bağlı halkalar oluşmuş, ancak lacked mekanik dayanımı ve tek eksenli çekme testi ilk precycling aşamalarında kırdı.
| n | Hücre sayısı | Kalınlığı (mm) | Kültür uzunluğu (gün) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Arıza suşu (mm / mm) | |
| rSMC halkaları | 6 | 660.000 | 0.94 ± 0.12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0.50 ± 0.08 |
| rSMC halkaları | 4 | 500.000 | 0.53 ± 0.02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0.88 ± 0.05 |
| HSMC halkaları | 3 | 750.000 | 0.51 ± 0.05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0.92 ± 0.08 |
| hMSC halkaları | 3 | 750.000 | 0.40 ± 0.07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tablo 1. Kültür parametreleri ve farklı hücre tipleri, tohum konsantrasyonları, ve kültür süreleri üretilen 2 mm halkaları mekanik özelliklerini gösteren tablo.
Şekil 1 (A) doku halka oluşturma süreci şematik. (B) Özel öğütülmüş anüler kuyuları ile polikarbonat kalıp. Merkez yazılan çapları 2 mm. (C) polikarbonat kalıp uzak soyuldu sonra PDMS şablon. (D) Toplulaştırılmış doku halkası, 2 mm bir yazı ile bir agaroz kalıp kültür. PBS içinde (E) İki mm çapında doku halkası. Ölçek bar = 6 mm (B, C) ve 2 mm (D, E).
Şekil 2 gerilme-şekil değiştirme eğrisi süreden Temsilcisi arsatek eksenli çekme testi CED.
Discussion
Son zamanlarda, hücre tabanlı veya "iskele-az" doku mühendisliği yöntemleri iskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları bazı sınırlamaları adresi artan bir ilgi olmuştur. Hücre kökenli dokuların hücreleri oluşturulur ve ürettikleri matrisi, onlar doğal olarak çok daha fazla hücre yoğunlukları içeren herhangi bir eksojen maddeler içermez ve tamamen insan hücreleri ve protein yapılabilir olduğunu verilmiştir. Vasküler greftler insan hücrelerinde yapılan eksojen iskeleleri olmaması (örneğin, patlama basınçları insan safen venler için 1600 mmHg göre 3400 mmHg) 12 önemli mekanik gücü elde edebilirsiniz. Vasküler dokularda hücre tabanlı gelişmiş hücre yoğunluğu ve mekanik dayanım, en güncel imalat yöntemleri ("sac-bazlı mühendislik" 3,4,12 veya "bioprinting" 5,13 gibi) gösterir rağmen geniş kültürünün bir süre (> 3 ay) gerektiren veya 3D doku yapımı için özel ekipman. Hücre kökenli doku halka method Burada anlatılan kısa bir süre içinde ve özel ekipman kullanımı olmadan sağlam bir 3D doku yapıları oluşturmak için hızlı hücresel kendini montaj sağlar.
Bu protokol, 2 mm iç çapı sıçan düz kas hücre kaynaklı doku halkaları oluşturmak için geliştirilen prosedürü. Bu örnekte, doku yüzük 7 gün için (daha sonra halka füzyon ve tüp oluşumu için ek bir 7 gün süreyle kültüre) kültüre edildi. Ancak, bir gün sonra hücre tohumlama gibi erken 2 mm sıçan (insan), düz kas hücre halkaları kuyulardan kaldırılır ve (örneğin, silikon tüpler üzerine, transfer) kullanım için yeteri kadar güçlü olabilir. Buna ek olarak, sadece orijinal polikarbonat kalıp sonrası çapı değiştirerek, değişen iç çaplarda (2, 4 ve 6 mm) ile sağlam doku halkalar bu yöntem ile oluşturulabilir. 8 Ayrıca, son beş 2 etkinleştirmek için polikarbonat kalıp tasarımı değiştirilmiş tek bir multi-kuyu agaroz kamara dökme mm tohumlama kuyu,PDMS ve agaroz daha az kullanır ve 6-plaka (veriler gösterilmemiştir) iyi bir sığar. Yazılan çaplı değişiklikler, iyi tohumlama genişlik, yuvarlak alt eğrilik yarıçapı, tohumlama kuyu, ya da tohum kuyuların derinliği sayısı sadece CNC CAD dosyası özellikleri değiştirerek değiştirilebilir. polikarbonat kalıp işleme. Sonunda, tek bir polikarbonat kalıp PDMS şablonları sınırsız sayıda imal etmek için kullanılan, ve her bir PDMS şablon temizlenir, otoklavlanabilir ve onlarca kez yeniden.
Birincil sıçan SMC'lere (Hücre Uygulamaları, R354-05), birincil insan koroner arter SMC'lere (Lonza, CC-2583), birincil insan doku halkalar boyutu değiştirmenin yanı sıra, biz de dahil olmak, pek çok farklı hücre tipleri halkaları yaptık dermal fibroblastlar 11 (Dr George Pins cömert bir hediye, TEFE Biyomedikal Mühendisliği Bölümü), sıçan akciğer fibroblastlar (RFL-6, ATCC CCL-192) ve mezenkimal kök hücreler (Lonza PT-2501). Bu hücre tiplerinin agrega ve doku halkaları oluşturmak için merkezi Mesajları etrafında sözleşmeleri her hücresel organizasyonu, ECM, kompozisyon ve yapıları mekanik özellikleri her hücre tipi için farklı olsa da. Her bir hücre tipi için ekim parametreleri deneysel hücrelerinin büyüklüğü ve yeteneklerini agrega göre tespit edilmelidir. Bu nedenle, hücre kökenli doku halkalar oluşturarak bu sistemi son derece çok yönlü ise, protokol farklı hücre tipleri ile uygun doku oluşumu için ufak ayarlamalar gerekebilir.
Doku halka geometri, açıklandığı gibi, tek eksenli çekme testi ile doku malzeme özellikleri, kolay yükleme ve değerlendirme kolaylaştırır. Damar kasılması ve fizyolojik fonksiyonu ölçmek için kan damarı halkanın kullanmak için önemli bir emsal de yoktur. Hazırlık çalışmaları hücre kökenli doku halkaları farmakolojik yanıt ölçümü için bir tel myograph cihazı monte edilebilir olduğunu gösterir vekasılma kuvveti nesil (veriler gösterilmemiştir). Toplamda, yeteneği, histolojik, mekanik, fizyolojik ve biyokimyasal analiz için hızlı bir şekilde kendi kendine monte hücre halkaları imal sağlığı ve hastalıkları, vasküler doku yapısı ve fonksiyonu modelleme için yararlı olabilecek yeni ve güçlü bir araç göstermektedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle Neil Whitehouse (TEFE, Higgins Makine Atölyesi), CNC işleme ile yaptığı yardım için kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, biz Camtasia yardım için MATLAB programlama yanı sıra Kate İçecek ve Joseph Cotnoir (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) ile ona yardım için Adriana Hera (TEFE Bilgisayar ve İletişim Merkezi) teşekkür etmek istiyorum. Sophie Burke ve Jacleen Becker (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) tamamlayıcı video görüntüleri sağladı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R15 HL097332), UMass Tıp Fakültesi-TEFE Pilot Araştırma Girişimi, Amerikan Kalp Derneği (JZH Lisans Araştırma Bursu) ve Worcester Politeknik Enstitüsü (JZH ve kurumsal Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi ) MWR fon start-up.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
