Summary
Cet article décrit une méthode souple pour créer des anneaux de tissu cellulaire dérivée par auto-assemblage cellulaire. Les cellules musculaires lisses ensemencées dans annulaires global d'agarose des puits et des contrats pour former robustes en trois dimensions (3D) des tissus dans les 7 jours. Anneaux de tissu à l'échelle millimétrique sont propices à des essais mécaniques et de servir comme blocs de construction pour l'assemblage des tissus.
Abstract
Chaque année, des centaines de milliers de patients subissent un pontage coronarien dans les États-Unis. 1 Environ un tiers de ces patients n'ont pas adaptée navires donneurs autologues en raison de la progression de la maladie ou de la récolte précédente. Le but de l'ingénierie des tissus vasculaires est de développer une source de remplacement appropriées pour ces pontages. En outre, les tissus vasculaires conçues peuvent s'avérer utiles en tant que modèles vivants vasculaires pour étudier les maladies cardio-vasculaires. Plusieurs approches prometteuses pour les vaisseaux sanguins d'ingénierie ont été explorées, avec de nombreuses études récentes portant sur le développement et l'analyse des cellules à base de méthodes. 2-5 Ici, nous présentons une méthode pour s'auto-assembler rapidement les cellules en bagues tissus 3D qui peuvent être utilisés dans in vitro pour modéliser les tissus vasculaires.
Pour ce faire, des suspensions de cellules musculaires lisses sont ensemencées dans des puits à fond rond annulaire agarose. Les propriétés non adhésives de l'agarose permettent èmecellules e à régler, des agrégats et du contrat autour d'un poteau au centre du puits pour former un anneau de tissu cohésifs. 6,7 Ces anneaux peuvent être cultivées pendant plusieurs jours avant la récolte pour les mécaniques, physiologiques, analyse biochimique, ou histologique. Nous avons montré que ces anneaux de tissu cellulaire dérivée des rendements à 100-500 kPa ultime résistance à la traction 8 qui dépasse la valeur déclarée pour les constructions autres tissus vasculaires conçu pour des durées de culture similaire (<30 kPa) 9,10. Nos résultats démontrent que des cellules robustes dérivés de génération vasculaires anneau de tissu peut être atteint dans un court laps de temps, et offre la possibilité pour l'évaluation directe et quantitative de la contribution des cellules dérivées de cellules et de matrice (MDP) pour la structure du tissu vasculaire et la fonction.
Protocol
1. Fabrication de moules cellulaire d'ensemencement
Commencez par fraisage d'une 1 / 2 "morceau épais de polycarbonate pour créer 15, à fond rond, puits annulaire avec un diamètre poteau central de 2 mm. Les canaux sont fraisées de 6 mm de profondeur et 3,75 mm de large. Nettoyez et séchez le moule polycarbonate enlever tous les débris de plastique du processus de broyage.
Mélanger polydiméthylsiloxane (PDMS) à un ratio 10:1 (p / p) de la base d'agent de durcissement, Degas à supprimer toutes les bulles d'air, et versez sur le moule en polycarbonate. Degas à nouveau pour éliminer les bulles restent, et de guérir dans l'étuve à 60 ° C pendant 4 heures.
Une fois durci, retirez soigneusement le modèle PDMS par lentement éplucher loin du polycarbonate, laver avec du savon et de l'eau, et autoclave. Aussi l'autoclave une solution de deux pour cent (p / v) agarose dissous dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM).
Placer le gabarit de PDMS sur une surface plane et remplissez avec fondue aga augmenté en commençant par pipetage agarose dans chacun des moules après le centre, puis pipetage dans l'espace autour d'elle. Laisser l'agarose à solidifier (environ 15 minutes), puis inverser le moule pour libérer l'agarose par le PDMS. Couper l'excès d'agarose à travers chacun des puits, et la place des puits d'agarose en plaques de 12 puits.
2. La culture cellulaire et l'ensemencement anneau
Ajouter culture cellulaire médias (DMEM avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine) autour de l'extérieur du moule d'agarose, sans couvrir le haut du moule. Placer les plaques dans l'incubateur et leur permettre de s'équilibrer pendant environ 15 minutes pendant que vous préparez les cellules.
À 90% de confluence, les cellules de rats trypsiniser du muscle lisse aortique (FFRS) et remettre à une concentration de 5x10 6 cellules / ml. Pipeter 100 pi de suspension cellulaire dans chaque puits de l'annulaire d'agarose, en utilisant un mouvement circulaire à appliquer aux cellules de chaque puits.
contenu »> Assurez-vous que les étagères sont incubateur niveau, puis placer les plaques dans l'incubateur et à leur permettre de s'asseoir tranquille pendant 24 heures. média d'échange tous les deux jours suivants, en aspirant les médias de partout dans le bien, et re-remplissage de chaque bien jusqu'à la agarose est bien complètement submergé.3. La récolte anneau de tissus et de mesures d'épaisseur
A l'issue de la culture, retirer l'anneau du moule d'agarose en le faisant glisser sur le dessus de la poste centrale.
Placez l'anneau dans une petite boîte de Petri avec un tampon phosphate salin (PBS), centre de l'échantillon, et d'acquérir une image en utilisant un système d'imagerie numérique.
Utilisez un programme d'analyse d'image pour la détection de contours et de mesurer l'épaisseur de l'anneau en 4 positions (haut, bas, gauche et droite) autour de sa circonférence. Calculer la valeur de l'épaisseur moyenne (t) pour chaque anneau individuel, et utiliser cette valeur pour calculer la surface de section transversale(2π (t / 2) 2).
4. Essais mécaniques des anneaux
Mettre en place la machine de traction (Instron EPS 1000) dans la position horizontale. Fixer une cellule de charge ± 1N 1mn et personnalisés poignées mince fil de fer (créée par la flexion fil d'acier inoxydable).
Mont de l'échantillon anneau sur les deux poignées de fil mince. Étendre les poignées jusqu'à ce qu'un 5 mN tare charge est appliquée à l'échantillon. Entrez dans la zone transversale (calculé à partir des mesures d'épaisseur) et d'enregistrer la longueur du calibre.
Pré-cycle de l'anneaux 8 fois entre la charge de tare et 50 kPa de stress à un taux de 10 mm / min. Après le huitième cycle de pré-, tirer à l'échec à 10 mm / min. L'échec est noté comme une diminution de la force par 40% d'une mesure à l'autre. Pour chaque échantillon, anneau, de mesurer la contrainte de traction (UTS) et déformation à la rupture et de calculer le module tangent maximum (MTM) à partir des données acquises.
5. Anneau de tissu commesemblée pour fabriquer des tubes de tissu
Porte-tubes personnalisés sont usinées à partir de 5 disques ronds en polycarbonate cm avec découpes rectangulaires (2 cm x 3 cm). Percez des trous filetés à travers ces disques pour permettre à deux détenteurs d'être vissés ensemble. Autoclaver les porte-tubes personnalisés, puis transfert à l'enceinte de sécurité biologique et les placer dans un plat de Petri vides.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les extrémités des tubes de 1,9 mm de diamètre en silicone à un angle de créer des bords biseautés, puis l'autoclave les tubes de silicone. Alors que les tubes sont autoclavés, remplir une boîte de Pétri avec les médias.
Retirer les bagues dans les puits d'agarose et les placer dans la boîte de Pétri avec les médias. Placer l'autoclave tubes de silicone dans le même plat de Pétri pour les mouiller avant de l'utiliser.
Utilisez une pince pour placer une extrémité biseautée d'un tube de silicone dans le centre d'un anneau et faites glisser doucement l'anneau sur le tube de silicone. Répéter avec le nombre souhaité de riNGS. Faites glisser les anneaux en contact avec eux par les poussant délicatement successivement dans les deux directions le long du tube. Cette méthode peut être utilisée pour les anneaux récoltés après une seule journée dans la culture.
Une fois que les anneaux sont montés, d'aligner les tubes de silicone dans les porteurs de polycarbonate et visser les deux parties du titulaire ensemble. Placez le support dans un plat de Pétri de 100 mm et ajouter 55 ml de milieu. Échange des médias tous les 3 jours pour la durée de la culture.
Pour enlever les tubes des tissus, des tubes de silicone communiqué du détenteur de polycarbonate et de l'utilisation des forceps pour faire glisser le tube de tissu hors du tube de silicone et dans une boîte de Petri remplie de PBS.
6. Les résultats représentatifs:
Lorsque le protocole est réalisé correctement, les cellules s'agrègent pour former des anneaux de tissu avec un diamètre intérieur égal au diamètre du moule correspondant au poste dans les 24 heures. Les bords anneau sont habituellement lisses en apparence et (si la cultured sur une surface plane), sont d'épaisseur uniforme sur toute la circonférence. Les anneaux de tissu sont faciles à manipuler et peut être démis de leurs puits pour l'analyse mécanique et histologiques ultérieures (voir en Gwyther et al., 2011 8). Morphologie anneau de tissus, composition de la matrice, et les propriétés mécaniques varient selon le nombre et le type de cellules ensemencées.
Les résultats représentatifs à partir des anneaux de tissu fabriqué à partir divers types de cellules, l'ensemencement des conditions, et la longueur de la culture sont présentés au tableau 1. Deux anneaux mm ID créé à partir de 5x10 5 FFRS présentaient une UTS supérieur anneaux créés à partir de notre publiés antérieurement 2 anneaux mm (fabriqués à partir de 5 6.6x10 FFRS). Similaire à 8 cellules de rat, cellules musculaires lisses humaines (HSMC) facilement agrégées pour former des tissus anneaux, qui contenait une grande quantité de collagène après seulement 14 jours de culture (données non présentées). Les cellules souches mésenchymateuses (hMSC) également regroupées et forment des anneaux cohérent, mais lala force mécanique et cked brisé pendant les phases initiales de test précyclage traction uniaxiale.
| n | Le nombre de cellules | Epaisseur (mm) | Longueur de la culture (jours) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Déformation à la rupture (mm / mm) | |
| anneaux FFRS | 6 | 660000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| anneaux FFRS | 4 | 500000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| anneaux HSMC | 3 | 750000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| anneaux hMSC | 3 | 750000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tableau 1. Tableau montrant les paramètres de la culture et des propriétés mécaniques de deux anneaux mm générées par différents types cellulaires, les concentrations de l'ensemencement, la culture et des durées.
Figure 1. (A) Schéma du processus de génération des tissus anneau. (B) personnalisé en polycarbonate moule avec fraisé puits annulaire. Diamètres de poste central sont de 2 mm. (C) modèle de PDMS après qu'il a été décollé du moule en polycarbonate. (D) anneau de tissus cultivés agrégées dans un moule d'agarose avec un poste de 2 mm. (E) mm Deux anneaux de tissu de diamètre dans du PBS. Barres d'échelle = mm 6 mm (B, C) et 2 (D, E).
Figure 2. Tracé représentatif de la courbe contrainte-déformation producteursced des essais de traction uniaxiale.
Discussion
Récemment, il ya eu un intérêt accru dans la cellule, ou «échafaudage moins" méthodes de l'ingénierie tissulaire pour répondre à certaines des limitations des approches basées sur échafaudage de l'ingénierie tissulaire. Étant donné que les cellules dérivées des tissus sont créées à partir de cellules et la matrice qu'ils produisent, ils contiennent des densités cellulaires intrinsèquement beaucoup plus élevé, ne contiennent pas de matériaux exogènes, et peut être faite entièrement à partir de cellules humaines et des protéines. Greffons vasculaires fabriqués à partir de cellules humaines peuvent atteindre une résistance mécanique importante en l'absence d'échafaudages exogènes (par exemple, la pression d'éclatement 3400 mmHg par rapport à 1600 mmHg pour les veines saphènes humaines) 12. Bien que basé sur des cellules tissus vasculaires présentent densité cellulaire améliorée et la résistance mécanique, méthodes de fabrication les plus courants (comme "feuille de base de l'ingénierie" 3,4,12 ou "bioprinting« 5,13) nécessitent des périodes de culture extensive (> 3 mois) ou des équipements spécialisés pour la construction du tissu 3D. L'anneau de tissus dérivés de cellules méthodesod décrite ici permet rapidement cellulaires auto-assemblage pour former des constructions robustes tissus 3D dans un court laps de temps et sans l'utilisation d'équipement spécialisé.
Ce protocole détaille la procédure que nous avons développé pour créer 2 mm rats diamètre intérieur des cellules musculaires lisses dérivées des anneaux de tissu. Dans le présent exemple, les anneaux de tissu ont été cultivées pendant 7 jours (ensuite cultivés pendant 7 jours supplémentaires pour la fusion anneau et la formation de tube). Cependant, 2 rats mm (et humain) en douceur anneaux cellules musculaires peuvent être retirés des puits et sont cohésives assez pour manipulation (par exemple, le transfert sur des tubes de silicone) dès le premier jour après l'ensemencement des cellules. En outre, les anneaux de tissu robuste avec différents diamètres intérieurs (2, 4 et 6 mm) peuvent être créés avec cette méthode en changeant simplement le diamètre message du moule original en polycarbonate. 8 Nous avons aussi récemment modifié la conception du moule en polycarbonate pour permettre à cinq 2 puits d'ensemencement mm et d'être jeté dans une chambre unique multi-puits d'agarose, quiutilise moins de PDMS et d'agarose, et s'inscrit dans un puits d'une plaque à 6 puits (données non présentées). Les changements dans le diamètre de poste, la largeur de l'ensemencement ainsi, le rayon de courbure du fond arrondi, le nombre de puits de semis, ou la profondeur des puits de semis peuvent tous être modifiés en changeant simplement le cahier des charges dans le fichier CAO pour CNC Usinage du moule en polycarbonate. Enfin, un moule unique en polycarbonate peut être utilisé pour fabriquer un nombre illimité de modèles PDMS, et chaque modèle de PDMS peuvent être nettoyés, autoclavés et réutilisés des dizaines de fois.
En plus de modifier la taille des anneaux de tissu, nous avons fait des anneaux à partir de nombreux types cellulaires différents, y compris: SMC primaires de rat (Applications Cell, R354-05), primaire humaine SMC artère coronaire (Lonza, CC-2583), primaires humains fibroblastes dermiques 11 (don généreux de broches George Dr, WPI Département de génie biomédical), les fibroblastes de poumon de rat (RLF-6, ATCC CCL-192), et les cellules souches mésenchymateuses (Lonza, PT-2501). Chacun de ces types cellulaires agrégats et des contrats dans le centre de messages pour former des anneaux de tissu, bien que l'organisation cellulaire, la composition d'ECM, et les propriétés mécaniques des constructions varient pour chaque type de cellule. Les paramètres d'ensemencement pour chaque type de cellule doit être déterminé de manière empirique basée sur la taille des cellules et leur capacité à s'agréger. Par conséquent, tout ce système de création de bagues tissus dérivés de cellules est extrêmement polyvalent, le protocole peut avoir besoin de légers ajustements à la formation tissulaire optimale avec différents types cellulaires.
La géométrie des tissus anneau facilite l'installation et l'évaluation des propriétés des matériaux des tissus par des tests de traction uniaxiale, tel que décrit. Il ya aussi un précédent important pour l'utilisation de segments de vaisseaux sanguins anneau pour mesurer la contraction vasculaire et la fonction physiologique. Des études préliminaires indiquent que les anneaux de tissus dérivés de cellules peut être monté sur un dispositif myographe fils pour la mesure de la réactivité pharmacologique etcontractiles de génération de force (données non présentées). Au total, la capacité de rapidement fabriquer des anneaux de cellules auto-assemblés pour l'analyse histologique, mécaniques, physiologiques et biochimiques suggèrent un nouvel outil puissant qui peut être utile pour la modélisation de la structure des tissus vasculaires et fonction dans la santé et la maladie.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Neil Whitehouse (WPI, atelier d'usinage Higgins) pour son aide dans l'usinage CNC. En outre, nous tenons à remercier Adriana Héra (WPI informatique et des communications Centre) pour son aide à la programmation MATLAB, ainsi que Kate boissons et Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) pour l'assistance avec Camtasia. Sophie Burke et Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) à condition séquences vidéo supplémentaires. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health (R15 HL097332), l'UMass Medical School-WPI initiative de recherche pilote, l'American Heart Association (bourse de recherche de premier cycle à JZH), et Worcester Polytechnic Institute (bourse de recherche de premier cycle à l'été JZH et institutionnels fonds de démarrage pour MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
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