Summary
Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine für Gewebe Montage.
Abstract
Jedes Jahr unterziehen sich Hunderttausende von Patienten einer koronaren Bypass-Operation in den Vereinigten Staaten. 1 Etwa ein Drittel dieser Patienten haben keine geeignete autologe Spender Schiffe wegen Fortschreiten der Erkrankung oder frühere Ernte. Das Ziel der vaskulären Tissue Engineering ist es, eine geeignete Alternative Quelle für diese Bypass-Transplantate entwickeln. Darüber hinaus kann technisch Gefäßgewebe als wertvoll erweisen als lebende vaskulären Modelle auf Herz-Kreislauf Erkrankungen zu studieren. Mehrere viel versprechende Ansätze zur technischen Blutgefäßen erforscht worden sind, mit vielen neueren Studien mit Schwerpunkt auf der Entwicklung und Analyse von Zell-basierten Methoden. 2-5 Hier stellen wir eine Methode, um schnell selbst montieren Zellen in 3D-Gewebe Ringe, die in verwendet werden können vitro zu modellieren Gefäßgewebe.
Um dies zu tun, sind Suspensionen von glatten Muskelzellen in Rundkolben ringförmigen Agarose Brunnen ausgesät. Die nicht-klebenden Eigenschaften der Agarose erlauben the-Zellen zu regeln, zu aggregieren und Vertrag um einen Stab in der Mitte des Brunnens zu einer zusammenhängenden Gewebe Ring bilden. 6,7 Diese Ringe können über mehrere Tage vor der Ernte für mechanische, physiologische, biochemische oder histologische Analyse kultiviert werden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellen abgeleiteten Gewebe Ringe bei 100-500 kPa Zugfestigkeit 8, die den Wert für andere Gewebezüchtung vaskulären Konstrukte für ähnliche Laufzeiten (<30 kPa) kultiviert berichtet übersteigt Ertrag. 9,10 Unsere Ergebnisse zeigen, dass stabile Zelle -derived Gefäßgewebe Ring Generation kann innerhalb kurzer Zeit erreicht werden kann, und bietet die Möglichkeit für direkte und quantitative Bewertung der Beiträge der Zellen und Zell-abgeleitete Matrix (CDM) zu Gefäßgewebe Struktur und Funktion.
Protocol
1. Zellaussaat Formenbau
Beginnen Sie mit dem Fräsen einer 1 / 2 "dickes Stück aus Polycarbonat bis 15, mit rundem Boden, ringförmigen Vertiefungen mit einer Mittelsäule Durchmesser von 2 mm zu schaffen. Die gefrästen Kanäle sind 6 mm tief und 3,75 mm breit. Reinigen und trocknen Sie das Polycarbonat Schimmel entfernen Sie alle Kunststoff-Ablagerungen aus dem Mahlvorgang.
Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) bei einem Verhältnis von 10:1 (w / w) von Base zu Härter, Degas, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie auf das Polycarbonat Form. Degas wieder entfernen Sie alle verbleibenden Blasen und Heilung in den Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden.
Einmal ausgehärtet, entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vorlage durch langsames Abziehen es weg von der Polycarbonat, mit Wasser und Seife waschen, und Autoklaven. Auch Autoklaven eine Lösung von zwei Prozent Agarose (w / v) gelöst in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM).
Legen Sie die PDMS-Vorlage auf eine ebene Fläche und füllen mit geschmolzenem aga stieg um ersten Pipettierung Agarose in jedem der Mitte nach Schimmel, und dann Pipettieren in den Raum um ihn herum. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen (ca. 15 Minuten), dann invertieren die Form der Agarose aus dem PDMS freizugeben. Cut über Agarose aus der ganzen jede der Vertiefungen und legen Sie die Agarose Bohrungen in 12-Well-Platten.
2. Zellkultur-und Ring-Aussaat
Add Zellkulturmedien (DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) um die Außenseite der Agarose Form, ohne die Oberseite der Formen. Legen Sie die Platten in den Inkubator und es ihnen ermöglichen, für ca. 15 Minuten ausgleichen, während Sie die Zellen herzustellen.
Bei 90% Konfluenz trypsinize Rattenaorta glatten Muskelzellen (rSMCs) und resuspendieren in einer Konzentration von 5x10 6 Zellen / ml. Je 100 ul Zellsuspension in jede der ringförmigen Agarose Brunnen, mit kreisenden Bewegungen, um Zellen in jede Vertiefung gelten.
content "> Stellen Sie sicher, Inkubator Regale sind Ebene, dann die Platten in den Inkubator und ihnen erlauben, sitzen 24 Stunden lang ungestört. Exchange Medium alle zwei Tage danach durch Ansaugen der Medien aus der ganzen gut, und re-Füllung in jede Vertiefung, bis die Agarose gut ist völlig untergetaucht.3. Tissue Ring Ernte-und Dickenmessung
Am Ende der Kultur, entfernen Sie den Ring aus der Agarose Form, indem Sie ihn über den Rand des Zentrums zu posten.
Legen Sie den Ring in einer kleinen Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in der Mitte der Probe, und erwerben Sie ein Bild mit einer digitalen Imaging-System.
Verwenden Sie eine Bildanalyse-Programm für die Kantenerkennung und messen die Dicke des Rings in 4 Positionen (oben, unten, links und rechts) um seinen Umfang. Berechnen Sie die mittlere Dicke Wert (t) für jeden einzelnen Ring, und verwenden Sie diesen Wert auf die Querschnittsfläche berechnen(2π (t / 2) 2).
4. Mechanische Prüfung von Ringen
Richten Sie die Zugprüfmaschine (Instron EPS 1000) in die horizontale Position. Bringen Sie eine 1N ± 1mN Wägezelle und benutzerdefinierte dünnen Draht Griffe (erstellt durch Biegen Edelstahlseile).
Montieren Sie den Ring Probe auf den beiden dünnen Draht Griffe. Verlängern Sie die Griffe bis zu einem 5 mN Taralast auf die Probe aufgebracht wird. Geben Sie die Querschnittsfläche (berechnet aus Dickenmessungen) und notieren Sie die Messlänge.
Pre-Zyklus der Ringe 8-mal zwischen den Taralast und 50 kPa Stress mit einer Geschwindigkeit von 10 mm / min. Nach dem achten pre-Zyklus, zum Scheitern zu ziehen bei 10 mm / min. Das Scheitern ist eine Abnahme der Kraft um 40% von einer Messung zur nächsten vermerkt. Für jeden Ring Probe messen die Zugfestigkeit (UTS) und Bruchdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangente Modul (MTM) aus den gewonnenen Daten.
5. Tissue-Ring alssammlung zu fertigen Gewebe Rohre
Benutzerdefinierte Rohrhalter aus Runde 5 cm Polycarbonat Scheiben mit rechteckigen Aussparungen (2 cm x 3 cm) bearbeitet. Drill Gewindebohrungen durch diese Scheiben zu ermöglichen zwei Halterungen miteinander verschraubt werden. Autoclave die benutzerdefinierte Gefäßhalter und dann Transfer zum Biosicherheitswerkbank und in eine leere Petrischale.
Verwenden chirurgische Schere an den Enden von 1,9 mm Durchmesser Silikonschläuche in einem Winkel zur abgeschrägten Kanten zu schaffen geschnitten und anschließend autoklavieren Silikonschläuche. Während die Rohre sind autoklaviert wird, füllen eine Petrischale mit Medien.
Entfernen Sie die Ringe von der Agarose Brunnen und legen Sie sie in der Petrischale mit den Medien. Ort autoklaviert Silikonschläuche in der gleichen Petrischale, um sie vor dem Gebrauch nass.
Verwenden einer Pinzette, um eine abgeschrägte Ende einer Silikon-Schlauch in der Mitte einen Ring Platz und schieben Sie den Ring auf den Silikonschlauch. Wiederholen Sie die gewünschte Anzahl von rings. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie ihn sie nacheinander in beiden Richtungen entlang der Röhre. Diese Methode kann für Ringe nach nur einem Tag in Kultur geerntet werden.
Sobald Ringe befestigt sind, richten Sie Silikonschläuche in der Polycarbonat-Halterungen ein und die beiden Teile der Halterung zusammen. Setzen Sie den Halter in eine 100 mm Petrischale und fügen 55 mL Medien. Börse Medien alle 3 Tage für die Dauer der Kultur.
Zum Entfernen des Gewebes Rohre, lassen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat Halter und Pinzette verwenden, um das Gewebe Rohre aus dem Silikon-Schlauch und in eine Petrischale mit PBS gefüllte Rutsche.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, aggregierte Zellen, Gewebe-Ringe mit einem inneren Durchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form post innerhalb von 24 Stunden zu bilden. Die Kanten des Rings sind in der Regel in Erscheinung glatt und (wenn cultured auf einer ebenen Fläche), sind in der Dicke um den gesamten Umfang einheitlich. Das Gewebe Ringe sind einfach zu handhaben und kann aus ihren Brunnen für nachfolgende mechanische und histologische Analyse (siehe in Gwyther et al., 2011 8) entfernt werden. Tissue Ring Morphologie, Matrix Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften variieren je nach Anzahl und Art der Zellen ausgesät.
Repräsentative Ergebnisse aus Gewebe Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat Bedingungen, und die Kultur der Länge hergestellt, sind in Tabelle 1 dargestellt. Zwei mm ID Ringe von 5x10 5 rSMCs erstellt zeigten eine höhere UTS als Ringe aus unserer bisher veröffentlichten 2 mm Ringe (aus 6.6x10 5 rSMCs) erstellt. 8 Ähnlich wie bei Ratten-Zellen, humanen glatten Muskelzellen (HSMC) leicht aggregiert, um Gewebe zu bilden Ringe, die eine große Menge von Kollagen nach nur 14 Tagen in Kultur (Daten nicht gezeigt) enthalten. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) auch aggregiert und bilden geschlossene Ringe, sondern lacked mechanische Festigkeit und brach während der ersten precycling Phasen der einachsigen Zugversuch.
| n | Die Zellzahl | Dicke (mm) | Länge der Kultur (Tage) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Bruchdehnung (mm / mm) | |
| rSMC Ringe | 6 | 660.000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| rSMC Ringe | 4 | 500.000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| HSMC Ringe | 3 | 750.000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC Ringe | 3 | 750.000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabelle 1. Tabelle zeigt die Kultur Parameter und mechanischen Eigenschaften von 2 mm Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat-Konzentrationen und Kultur Dauer erzeugt.
Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des Gewebes Ring Generierung. (B) Custom Polycarbonat Form mit gefrästen ringförmigen Vertiefungen. Zentrale Poststelle Durchmesser 2 mm. (C) PDMS-Vorlage, nachdem sie weg war aus dem Polycarbonat Form geschält. (D) Aggregierte Gewebe Ring in einer Agarose-Form mit einer 2 mm post kultiviert. (E) Zwei mm Durchmesser Gewebe Ring in PBS. Maßstabsbalken = 6 mm (B, C) und 2 mm (D, E).
Abbildung 2. Representative Grundstück von Spannungs-Dehnungs-Kurve produced aus einachsigen Zugversuch.
Discussion
Seit kurzem besteht ein verstärktes Interesse an zell-basierte oder "Gerüst-less" Tissue Engineering Methoden, um einige der Einschränkungen von Gerüst-basierte Tissue Engineering Ansätze Adresse. Da cell-derived Gewebe aus Zellen bestehen und die Matrix die sie produzieren, sie von Natur aus enthalten viel höheren Zelldichten, enthalten keine körperfremden Materialien und kann vollständig aus menschlichen Zellen und Proteine hergestellt werden. Gefäßprothesen aus menschlichen Zellen hergestellt werden erhebliche mechanische Festigkeit in Abwesenheit von exogenen Gerüsten (zB Berstdruck 3400 mmHg im Vergleich zu 1600 mmHg für den menschlichen Stammvenen) 12 zu erreichen. Obwohl zellbasierten Gefäßgewebe verbesserte Zelldichte und mechanischer Festigkeit, die meisten aktuellen Herstellungsverfahren (z. B. "Blatt-based engineering" 3,4,12 oder "bioprinting" 5,13) weisen erfordern umfangreiche Kultur Zeiträume (> 3 Monate) oder Spezialausrüstung für 3D-Gewebe Konstruktion. Die cell-derived Gewebe Ring method hier beschriebenen ermöglicht eine schnelle zelluläre self-assembly, robuste 3D-Gewebe-Konstrukte in kurzer Zeit und ohne den Einsatz von Spezialgeräten zu bilden.
Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, das wir entwickelt, um 2 mm Innendurchmesser Ratte glatten Muskulatur cell-derived Gewebe Ringe zu erstellen. Im vorliegenden Beispiel wurden Gewebeproben Ringe für 7 Tage (dann weitere 7 Tage zur Anellierung und tube formation kultiviert) kultiviert. Allerdings, 2 mm Ratte (und menschliche) glatten Muskelzellen Ringe können aus den Vertiefungen entfernt werden und sind kohäsive genug für das Handling (zB Übertragung auf Silikonschläuche) bereits einen Tag nach Zellaussaat. Darüber hinaus kann robuste Gewebe Ringe mit unterschiedlichen Innendurchmessern (2, 4 und 6 mm) mit dieser Methode durch einfache Änderung der post Durchmesser des ursprünglichen Polycarbonat Form erstellt werden. 8 Wir haben kürzlich auch die Polycarbonat-Formenbau modifiziert, um fünf 2 ermöglichen mm Aussaat Brunnen in einem einzigen Multi-Well-Agarose Kammer gegossen werden, dieverbraucht weniger PDMS und Agarose, und passt in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Daten nicht gezeigt). Änderungen in der post Durchmesser, die Breite der Aussaat gut, der Radius der Krümmung der abgerundeten Boden, kann die Anzahl der Aussaat Brunnen, oder die Tiefe der Aussaat Brunnen alle einfach durch Änderung der Angaben in der CAD-Datei für CNC geändert werden Bearbeitung der Polycarbonat-Form. Schließlich kann ein einziger Polycarbonat Form verwendet werden, um eine unbegrenzte Anzahl von PDMS-Vorlagen herzustellen, und jede PDMS Vorlage gereinigt werden kann, autoklaviert und wieder dutzende Male.
Neben der Änderung der Größe des Gewebes Ringe haben wir Ringe aus vielen verschiedenen Zelltypen hergestellt, unter anderem: primären Ratten SMCs (Cell Applications, R354-05), primären humanen koronaren glatten Muskelzellen (Lonza, CC-2583), primäre humane Hautfibroblasten 11 (großzügige Schenkung von Dr. George Pins, WPI Abteilung für Biomedizinische Technik), Rattenlunge Fibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192) und mesenchymalen Stammzellen (Lonza, PT-2501). Jeder dieser Zelltypen Aggregate und Verträge rund um das Zentrum Beiträge von Gewebe Ringe bilden, obwohl die zelluläre Organisation, ECM Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften der Konstrukte variieren je nach Zelltyp. Die Aussaat Parameter für jeden Zelltyp muss empirisch auf der Grundlage der Größe der Zellen und ihre Fähigkeit zur Aggregation ermittelt werden. Während also dieses System zu schaffen, cell-derived Gewebe Ringe ist äußerst vielseitig, so kann das Protokoll müssen geringfügige Anpassungen für eine optimale Gewebsbildung mit verschiedenen Zelltypen.
Tissue Ringgeometrie erleichtert das Be-und Beurteilung von Gewebe Materialeigenschaften von einachsigen Zugversuch, wie beschrieben. Es gibt auch erhebliche Präzedenzfall für die Nutzung der Blutgefäße Ringsegmente zu Gefäßkontraktion und physiologische Funktion zu messen. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass cell-derived Gewebe Ringe auf einem Draht Myographions Gerät zur Messung der pharmakologischen Ansprechbarkeit montiert werden undKontraktionskraft Generation (Daten nicht gezeigt). Insgesamt deutet die Fähigkeit, schnell herzustellen self-assembled Zelle Ringe für die histologische, mechanische, physiologische und biochemische Analyse ein leistungsfähiges neues Werkzeug, die nützlich sein für die Modellierung Gefäßgewebe Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) für seine Hilfe bei der CNC-Bearbeitung. Darüber hinaus möchten wir Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) für ihre Hilfe bei MATLAB-Programmierung, sowie Kate Beverage und Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) danken für die Unterstützung bei Camtasia. Sophie Burke und Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) vorgesehen zusätzliche Videomaterial. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R15 HL097332), die UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, die American Heart Association (undergraduate Forschungsstipendium an JZH) und Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship an JZH und institutionelle finanziert Anschubfinanzierung für MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
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