Summary
Denne artikel skitserer en alsidig metode til at oprette celle-deriverede væv ringe af cellulære selvsamling. Glatte muskelceller seedet til ringformet agarose brønde samlet og kontrakt for at danne robuste tre-dimensionelle (3D) væv inden for 7 dage. Millimeter-skala væv ringe er befordrende for mekanisk afprøvning og tjene som byggesten for væv samling.
Abstract
Hvert år hundredtusindvis af patienter, der gennemgår koronar arterie bypass operation i USA. 1 Omkring en tredjedel af disse patienter ikke har egnet autolog Donorfartøjer pga. sygdomsprogression eller foregående høst. Formålet med vaskulære tissue engineering er at udvikle en egnet alternativ kilde til disse bypass grafts. Desuden kan manipuleret karvæv vise sig værdifuld som levende vaskulære modeller til at studere hjerte-kar-sygdomme. Flere lovende tilgange til ingeniør blodkar er blevet udforsket, med mange nyere undersøgelser, der fokuserer på udvikling og analyse af celle-baserede metoder. 2-5 heri, vi præsenterer en metode til hurtigt at selv samle celler i 3D væv ringe, der kan bruges i vitro til model vaskulære væv.
For at gøre dette, er suspensioner af glatte muskelceller seeded i rundbundet ringformede agarose brønde. De ikke-klæbende egenskaber agarose giver the celler til at slå sig ned, samlede og kontrakt omkring en stilling i centrum af brønden for at danne et sammenhængende væv ring. 6,7 Disse ringe kan dyrkes i flere dage før høst for mekaniske, fysiologiske, biokemiske eller histologiske analyse. Vi har vist, at disse celle-deriverede væv ringe udbytte ved 100-500 kPa trækstyrke 8, der overstiger værdien rapporteret for andre manipuleret væv vaskulære konstruerer kulturperler for lignende varigheder (<30 kPa). 9,10 Vores resultater viser, at robuste celle -afledte karvæv ring generation kan nås inden for en kort tidsperiode, og giver mulighed for direkte og kvantitativ vurdering af bidrag fra celler og celle-afledte matrix (CDM) til at karvæv struktur og funktion.
Protocol
1. Cell seeding skimmel fabrikation
Begynd med at fræse en 1 / 2 "tykt stykke polykarbonat til at oprette 15, rundbundet, ringformede brønde med et center indlæg diameter på 2 mm. Fræsede kanaler er 6 mm dyb og 3,75 mm brede. Rens og tør polycarbonat formen til fjerne enhver plastikaffald fra formaling processen.
Bland polydimethylsiloxan (PDMS) på en 10:1 ratio (w / w) af base til hærder, Degas til at fjerne alle luftbobler, og hæld det ud på polycarbonat formen. Degas igen for at fjerne eventuelle resterende bobler, og helbredelse i ovnen ved 60 ° C i 4 timer.
Når hærdet, forsigtigt fjerne PDMS skabelon ved langsomt at trække den væk fra polykarbonat, vask med sæbe og vand, og autoklaver. Også autoklave en opløsning af to procent agarose (w / v) opløst i Dulbecco ændrede Eagle medium (DMEM).
Placer PDMS skabelonen på en plan overflade og fyld med smeltet aga steg ved først pipettering agarose i hver af midter-forme, og derefter pipettering ud i rummet omkring det. Lad agarose at størkne (ca. 15 minutter), så vend formen at frigive agarose fra PDMS. Skær overskydende agarose fra omkring hver af brøndene, og placere agarose brønde i 12-godt plader.
2. Cellekultur og ring såning
Tilføj cellekulturmedier (DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) omkring ydersiden af agarose formen, uden at dække det øverste af formene. Anbring pladerne i rugemaskinen, og give dem mulighed for at udligne i ca 15 minutter, mens du forbereder celler.
Ved 90% sammenløb, trypsinize rotte aorta glatte muskelceller (rSMCs) og resuspender ved en koncentration på 5x10 6 celler / ml. Tilsæt 100 μL af cellesuspensionen i hvert af de ringformede agarose brønde ved hjælp af en cirkulær bevægelse for at anvende celler til hver brønd.
indhold "> Sørg for inkubatoren hylder niveau, og derefter placere pladerne i rugemaskinen, og give dem mulighed for at sidde uforstyrret i 24 timer. Exchange mellemstore hver to dage derefter ved sugning medier fra hele godt, og re-fyldning hver brønd, indtil agarose godt er helt neddykket.3. Tissue ring høst og tykkelse målinger
Ved afslutningen af kultur, fjerne ringen fra agarose formen ved at skubbe det over toppen af centeret indlæg.
Anbring ringen i en lille petriskål med fosfatbufferet saltvand (PBS), center prøven, og tilegne sig et billede ved hjælp af et digitalt billedbehandlingssystem.
Brug et billede analyseprogram for kantdetektering og måle tykkelsen af ringen i 4 positioner (top, bund, venstre og højre) omkring sin omkreds. Beregn den gennemsnitlige tykkelse værdi (t) for hver enkelt ring, og bruge denne værdi til at beregne tværsnitsareal(2π (t / 2) 2).
4. Mekanisk afprøvning af ringe
Konfigurer trækprøvemaskine (Instron EPS 1000) i vandret position. Vedhæft en 1N ± 1mN vejecelle og brugerdefinerede tynd wire håndtag (skabt ved at bøje rustfrit stål wire).
Montér ringen prøve på to tynde wire greb. Forlæng greb, indtil en 5 mN tara belastning påføres til prøven. Indtast tværsnitsareal (beregnet ud fra tykkelse målinger) og registrere målelængden.
Pre-cyklus ringene 8 gange mellem tara belastning og 50 kPa stress med en hastighed på 10 mm / min. Efter ottende pre-cyklus, træk til at mislykkes på 10 mm / min. Fiasko er noteret som et fald i kraft med 40% fra den ene måling til den næste. For hver ring prøve, måle den ultimative trækspændinger (UTS) og manglende belastning og beregne den maksimale tangent modulus (MTM) fra de indsamlede data.
5. Tissue ring somForsamlingsmodellens at fabrikere væv rør
Brugerdefinerede rørholdere er bearbejdet fra runde 5 cm polycarbonat diske med rektangulære udskæringer (2 cm x 3 cm). Bor gevindhuller gennem disse diske til at tillade to indehavere at blive skruet sammen. Autoklave den brugerdefinerede rørholdere, og derefter overføre til biosikkerhed kabinet og sted i en tom petriskål.
Brug kirurgisk saks til at skære enderne af 1,9 mm i diameter silikone slanger i en vinkel til at skabe facetkanter, og derefter autoklavere silikone rør. Mens rørene bliver autoklaveret, udfylde en petriskål med medie.
Fjern ringene fra agarose brønde og placere dem i petriskålen med medier. Placer autoklaveres silikone rør i samme petriskålen til våd dem før brug.
Brug pincet til at placere en skrå ende af en silikoneslange i midten af en ring og forsigtigt skubbe ringen på silikoneslanger. Gentag med det ønskede antal RINGS. Skub ringene i kontakt med hinanden ved forsigtigt at skubbe dem successivt i begge retninger langs røret. Denne metode kan bruges til at ringe høstet efter kun én dag i kultur.
Når ringene er monteret, tilslutter silikone rør i polycarbonat indehavere og skru de to dele af indehaverens sammen. Placer indehaveren i en 100 mm petriskål og tilsættes 55 ml medier. Exchange medier hver 3 dage for hele kulturen.
For at fjerne vævet rør, slippe silikone rør fra polycarbonat indehaveren og bruge pincet til at skubbe vævet rør fra silikoneslange og ind i en petriskål fyldt med PBS.
6. Repræsentative resultater:
Når protokollen er udført korrekt, celler samlet til at danne væv ringe med en indre diameter svarende til diameteren af den tilsvarende formen post inden for 24 timer. Ringen kanter er normalt glat i udseende og (hvis kultued på en plan overflade), er ensartede i tykkelse rundt om hele omkredsen. Vævet Ringene er let at håndtere og kan fjernes fra deres brønde for efterfølgende mekanisk og histologiske analyse (se i Gwyther et al., 2011 8). Tissue ring morfologi, matrix sammensætning, og mekaniske egenskaber varierer afhængigt af antallet og typen af seedede celler.
Repræsentative resultater fra væv ringe lavet af forskellige celletyper, såning vilkår og kultur længde er vist i tabel 1. To mm ID ringe skabt af 5x10 5 rSMCs udstillet en højere UTS end ringe skabt ud fra vores tidligere offentliggjorte 2 mm ringe (fremstillet af 6.6x10 5 rSMCs). 8 Svarende til rotte celler, humane glatte muskelceller (hSMC) umiddelbart aggregeres til at danne væv ringe, som indeholdt en stor mængde af kollagen efter kun 14 dage i kultur (data ikke vist). Menneskelige mesenchymale stamceller (hMSC) også aggregeret og dannet sammenhængende ringe, men lacked mekanisk styrke og brød i den indledende precycling faser af en-akset trækprøvning.
| n | Celle nummer | Tykkelse (mm) | Længde af kultur (dage) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Fejl stamme (mm / mm) | |
| rSMC ringe | 6 | 660.000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| rSMC ringe | 4 | 500.000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| hSMC ringe | 3 | 750.000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC ringe | 3 | 750.000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabel 1. Tabel over den kultur parametre og mekaniske egenskaber af 2 mm ringe genereret fra forskellige celletyper, såning koncentrationer, og kultur varigheder.
Figur 1. (A) Skematisk i vævet ringen generation proces. (B) Custom polycarbonat form med fræset annular brønde. Centrale post diametre er 2 mm. (C) PDMS skabelon, efter at det blev skrællet væk fra polycarbonat formen. (D) aggregerede væv ring kulturperler i en agarose form med en 2 mm indlæg. (E) To mm i diameter og væv ring i PBS. Skala barer = 6 mm (B, C) og 2 mm (D, E).
Figur 2. Repræsentant grund af stress-strain kurve produCED fra enaksede trækprøvning.
Discussion
For nylig har der været en øget interesse i celle-baserede eller "stillads-mindre" tissue engineering metoder til at løse nogle af de begrænsninger af stillads-baserede tissue engineering tilgange. I betragtning af, at celle-afledt væv er skabt af celler og matrix, de producerer, er de i sagens natur indeholder meget højere celle tætheder, indeholder ingen eksogene materialer, og kan laves helt fra humane celler og proteiner. Vaskulære vin lavet af menneskeceller kan opnå betydelig mekanisk styrke i mangel af eksogene stilladser (f.eks sprængtryk 3400 mmHg i forhold til 1600 mmHg for human saphenous vener) 12. Selvom cellebaserede karvæv udstille forbedret celletæthed og mekanisk styrke, de fleste nuværende fabrikation metoder (såsom "ark-baserede engineering" 3,4,12 eller "bioprinting" 5,13) kræve omfattende kultur perioder (> 3 måneder) eller specialudstyr til 3D væv byggeri. Den celle-afledte væv ring metoderod beskrevet her muliggør hurtig cellulær selvsamling at danne robuste 3D væv konstruerer inden for en kort periode og uden brug af specialudstyr.
Denne protokol beskriver den procedure, vi har udviklet til at skabe 2 mm indvendig diameter rotte glatte muskelceller afledt væv ringe. I det aktuelle eksempel var væv ringe dyrket i 7 dage (dengang kulturperler i yderligere 7 dage for ring fusion og rør dannelse). Men 2 mm rotte (og menneskelige) glatte muskelceller ringe kan fjernes fra brøndene og er sammenhængende nok til håndtering (fx overførsel til silikone rør) så tidligt som en dag efter celle såning. Derudover kan robust væv ringe med varierende indre diameter (2, 4 og 6 mm) være skabt med denne metode ved blot at ændre stillingen diameteren af den oprindelige polycarbonat formen. 8 Vi har også for nylig ændret polycarbonat design støbeforme, så fem 2 mm såning brønde til at blive kastet i en enkelt multi-godt agarose kammer, sombruger mindre PDMS og agarose, og passer i en brønd i en 6-brønds plade (data ikke vist). Ændringer i stillingen diameter, bredden af seeding godt, krumningsradius af afrundede bund, kan antallet af såning brønde, eller dybden af seeding brønde alle ændres blot ved at ændre specifikationerne i CAD-fil til CNC bearbejdning af polycarbonat mug. Endelig kan en enkelt polycarbonat støbeform bruges til at fremstille et ubegrænset antal PDMS skabeloner, og hver PDMS skabelon kan rengøres, autoklaveres og genbruges snesevis af gange.
Ud over at ændre størrelsen af vævet ringe, har vi lavet ringe fra mange forskellige celletyper, herunder: primær rotte SMCs (Cell Applications, R354-05), primære humane kranspulsåren SMCs (Lonza, CC-2583), primære humane dermale fibroblaster 11 (generøse gave af Dr. George Pins, WPI Afdeling for Biomedical Engineering), rotte lungefibroblaster (RFL-6, ATCC CCL-192), og mesenkymale stamceller (Lonza, PT-2501). Hver af disse celletyper aggregater og kontrakter omkring centrum indlæg til at danne væv ringe, selv om det cellulære organisation, ECM sammensætning, og mekaniske egenskaber konstruerer varierer for hver celle type. Det seeding parametre for hver celle type skal være empirisk afgøres baseret på størrelsen af celler og deres evne til at sammenlægge. Derfor, mens dette system for at skabe celle-afledte væv ringene er meget alsidig, kan protokollen behov små justeringer for optimal vævsdannelse med forskellige celletyper.
Tissue ring geometri gør det nemt at læsse og vurdering af vævsmateriale egenskaber ved enaksede trækprøvning, som beskrevet. Der er også betydelige præcedens for at bruge blodkar ring segmenter til at måle vaskulær kontraktion og fysiologiske funktion. Foreløbige undersøgelser tyder på, at celle-deriverede væv ringe kan monteres på en ledning myograph enhed til måling af farmakologiske lydhørhed ogkontraktile kraft generation (data ikke vist). Alt i alt, evnen til hurtigt at fabrikere selv-samlet celle ringe til histologiske, mekaniske, fysiologiske og biokemiske analyser tyder på et kraftfuldt nyt værktøj, der kan være nyttige til modellering karvæv struktur og funktion i sundhed og sygdom.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) for hans hjælp med CNC bearbejdning. Desuden vil vi gerne takke Adriana Hera (WPI computer-og kommunikations center) for hendes hjælp med MATLAB programmering, samt Kate drikkevarer og Joseph Cotnoir (WPI Akademisk Technology Center) for at få hjælp med Camtasia. Sophie Burke og Jacleen Becker (WPI Akademisk Technology Center), forudsat supplerende video-optagelser. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (R15 HL097332), den UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (bachelor forskning stipendium til at JZH), og Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship til JZH og institutionelle start-up midler til MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
