Summary
Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.
Abstract
Elk jaar honderdduizenden patiënten ondergaan coronaire bypass operatie in de Verenigde Staten. 1 Ongeveer een derde van deze patiënten niet geschikt autologe donor schepen te wijten aan progressie van de ziekte of de vorige oogst. Het doel van vasculaire tissue engineering is het ontwikkelen van een geschikte alternatieve bron voor deze bypass grafts. Daarbij mag engineered vasculair weefsel waardevol blijken als levende vasculaire modellen om hart-en vaatziekten te bestuderen. Verschillende veelbelovende benaderingen van techniek bloedvaten zijn onderzocht, met vele recente studies gericht op de ontwikkeling en analyse van cel-gebaseerde methoden. 2-5 Hierin presenteren we een methode om snel zelf te monteren cellen in 3D weefsel ringen die kunnen worden gebruikt in vitro te vaatweefsel model.
Om dit te doen, zijn suspensies van gladde spiercellen gezaaid in de ronde bodem ringvormige agarose putten. De niet-klevende eigenschappen van de agarose toe ee-cellen om zich te vestigen, aggregaat en contract rond een paal in het midden van de put om een samenhangend weefsel ring te vormen. 6,7 Deze ringen kunnen worden gekweekt voor enkele dagen vóór de oogst voor mechanische, fysiologische, biochemische of histologische analyse. We hebben aangetoond dat deze cel afkomstige weefsel ringen opbrengst bij 100-500 kPa treksterkte 8 die de waarde gerapporteerd voor andere weefselmanipulatieproducten vasculaire bouwt gekweekt voor vergelijkbare looptijden (<30 kPa) overschrijdt. 9,10 Onze resultaten tonen aan dat robuuste cel afgeleide vaatweefsel ring generatie kan worden bereikt binnen een korte tijd, en biedt de mogelijkheid voor directe en kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van cellen en cel afkomstige matrix (CDM) aan de vasculair weefsel structuur en functie.
Protocol
1. Cel zaaien schimmel fabricage
Begin met het frezen van een 1 / 2 "dik stuk polycarbonaat tot 15, met ronde bodem, ringvormige putten te creëren met een centrale zuil diameter van 2 mm. De gefreesde kanalen zijn 6 mm diep en 3,75 mm breed. Reinigen en de polycarbonaat mal om te drogen Verwijder alle plastic afval uit het maalproces.
Mix polydimethylsiloxaan (PDMS) in een 10:01 verhouding (w / w) van de basis om verharder, Degas om alle luchtbellen te verwijderen, en giet op de polycarbonaat mal. Degas weer om alle resterende luchtbellen te verwijderen, en genezen in de oven op 60 ° C gedurende 4 uur.
Eenmaal uitgehard, voorzichtig de PDMS sjabloon te verwijderen door langzaam pellen uit de buurt van het polycarbonaat, wassen met zeep en water, en autoclaaf. Ook autoclaaf een oplossing van twee procent agarose (w / v) opgelost in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM).
Leg de PDMS sjabloon op een vlakke ondergrond en vul met gesmolten aga steeg door eerst pipetteren agarose in elk van het centrum na de mallen, en dan pipetteren in de ruimte eromheen. Laat de agarose te stollen (ongeveer 15 minuten), keer dan de mal om de agarose release van het PDMS. Knip overtollige agarose uit rond elk van de putten, en plaats de agarose putten in 12-well platen.
2. Celcultuur en ring zaaien
Voeg celcultuur media (DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine) rond de buitenkant van de agarose mal, zonder dat die de bovenkant van de mallen. Plaats de platen in de couveuse en laat ze in evenwicht voor ongeveer 15 minuten, terwijl u de voorbereiding van de cellen.
Bij 90% confluentie, trypsinize rat aorta gladde spiercellen (rSMCs) en resuspendeer bij een concentratie van 5x10 6 cellen / ml. Pipetteer 100 ui celsuspensie in elk van de ringvormige agarose putten, met behulp van een draaiende beweging naar de cellen toe te passen aan elke well.
content "> Zorg ervoor dat incubator rekken zijn niveau, dan plaatst u de platen in de couveuse en laat ze ongestoord gaan zitten voor 24 uur. Exchange medium om de twee dagen daarna door opzuigen in de media van rond de put, en opnieuw vullen van elk goed tot de agarose goed is volledig ondergedompeld zijn.3. Tissue ring oogsten en diktemetingen
Aan het einde van de cultuur, haal de ring uit de agarose mal door te schuiven over de bovenkant van het centrum post.
Leg de ring in een kleine petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), in het midden van het monster, en het verwerven van een afbeelding met behulp van een digitaal imaging systeem.
Gebruik een beeldanalyse-programma voor randdetectie en meet de dikte van de ring in vier posities (boven, onder, links en rechts) rond zijn omtrek. Bereken de gemiddelde dikte waarde (t) voor elke individuele ring, en deze waarde gebruiken om de doorsnede te berekenen(2π (t / 2) 2).
4. Mechanische beproeving van ringen
Stel de trekbank (Instron EPS 1000) in de horizontale positie. Bevestig een 1N ± 1mn load cell en aangepaste dunne draad grepen (gemaakt door het buigen van roestvrij staaldraad).
Monteer de ring monster op de twee dunne draad grips. Uitbreiding van de handgrepen tot een 5 mN tarra belasting wordt toegepast op het monster. Voer de doorsnede (berekend op basis van dikte metingen) en noteer de meter lengte.
Pre-cyclus van de ringen 8 keer tussen de tarra belasting en 50 kPa stress op een snelheid van 10 mm / min. Na de achtste pre-cyclus, trek te mislukken bij 10 mm / min. Falen wordt genoteerd als een afname van kracht met 40% van een meting naar de volgende. Voor elke ring monster, het meten van de breukspanning stress (UTS) en mislukking stam en het berekenen van de maximale tangent modulus (MTM) van de verkregen gegevens.
5. Tissue ring alstage aan weefsel buizen fabriceren
Aangepaste buis houders zijn vervaardigd uit rond 5 cm polycarbonaat schijven met rechthoekige uitsparingen (2 cm x 3 cm). Boor schroefgaten door middel van deze schijven om twee houders aan elkaar worden geschroefd. Autoclaaf de aangepaste buis houders, en vervolgens naar de bioveiligheid kast en plaats het in een lege petrischaal.
Gebruik chirurgische schaar aan de uiteinden van 1,9 mm diameter siliconen buisjes snijden onder een hoek met afgeschuinde randen maken en vervolgens de siliconen buisjes autoclaaf. Terwijl de buizen worden geautoclaveerd, vul een petrischaal met media.
Verwijder de ringen uit de agarose putten en plaats ze in de petrischaal met media. Plaats siliconen buisjes geautoclaveerd in dezelfde petrischaal om ze te nat voor gebruik.
Gebruik een tang om een schuine uiteinde van een siliconen buisje plaatsen in het midden van een ring en voorzichtig de ring schuif op de siliconen slang. Herhaal dit met het gewenste aantal riNGS. Schuif de ringen in contact met elkaar door zachtjes duwen ze achtereenvolgens in beide richtingen langs de buis. Deze methode kan worden gebruikt voor ringen geoogst na slechts een dag in cultuur.
Zodra ringen zijn gemonteerd, sluiten silicone buizen in de polycarbonaat houders en samen schroef de twee delen van de houder. Plaats de houder in een 100 mm petrischaaltje en voeg 55 ml media. Exchange media om de 3 dagen voor de duur van de cultuur.
Voor het verwijderen van het weefsel buizen, laat u de silicone buizen van polycarbonaat de houder en een tang om het weefsel buizen glijden van de siliconen tube en in een petrischaal gevuld met PBS.
6. Representatieve resultaten:
Wanneer het protocol correct wordt uitgevoerd, worden de cellen aggregaat om weefsel ringen vormen met een inwendige diameter gelijk aan de diameter van de overeenkomstige mal post binnen 24 uur. De ring randen zijn gewoonlijk vlot in verschijning en (indien van culed op een vlakke ondergrond), zijn overal even dik rond de gehele omtrek. Het weefsel ringen zijn gemakkelijk te hanteren en kunnen worden verwijderd uit hun putten voor de volgende mechanische en histologische analyse (zie in Gwyther et al.., 2011 8). Tissue ring morfologie, matrix samenstelling en de mechanische eigenschappen variëren, afhankelijk van het aantal en het type van geënte cellen.
Representatieve resultaten van weefsel ringen gemaakt van verschillende celtypes, zaaien voorwaarden, en de cultuur lengte zijn weergegeven in Tabel 1. Twee mm ID ringen gemaakt van 5x10 5 rSMCs vertoonden een hoger UTS dan ringen gemaakt van onze eerder gepubliceerde 2 mm ringen (gemaakt van 6.6x10 5 rSMCs). 8 Net als rat cellen, humane gladde spiercellen (HSMC) gemakkelijk geaggregeerd tot weefsel te vormen ringen, die een grote hoeveelheid collageen die na slechts 14 dagen in de cultuur (gegevens niet getoond). Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) ook samengevoegd en vormden samenhangende ringen, maar lacked mechanische sterkte en brak tijdens de eerste fasen van precycling eenassige treksterkte testen.
| n | Aantal cellen | Dikte (mm) | Lengte van de cultuur (dagen) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Falen stam (mm / mm) | |
| rSMC ringen | 6 | 660.000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| rSMC ringen | 4 | 500.000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| HSMC ringen | 3 | 750.000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC ringen | 3 | 750.000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabel 1. Tabel met de cultuur van parameters en mechanische eigenschappen van 2 mm ringen gegenereerd uit verschillende celtypen, zaaien concentraties, en de cultuur duur.
Figuur 1. (A) Schematische weergave van het weefsel ring generatie proces. (B) Custom polycarbonaat mal met gefreesde ringvormige putten. Centrale post diameters zijn 2 mm. (C) PDMS sjabloon nadat hij weg was gepeld uit het polycarbonaat mal. (D) Geaggregeerde weefsel ring gekweekt in een agarose mal met een 2 mm post. (E) Twee mm diameter weefsel ring in PBS. Schaal bars = 6 mm (B, C) en 2 mm (D, E).
Figuur 2. Vertegenwoordiger plot van stress-strain curve produCED van eenassige treksterkte testen.
Discussion
Onlangs is er een toegenomen belangstelling voor cel-gebaseerde of 'steiger-less "tissue engineering methoden om enkele van de beperkingen van de steiger op basis van tissue engineering benaderingen. Gezien het feit dat uit de cel afkomstige weefsels worden gemaakt van cellen en de matrix die ze produceren, ze van nature bevatten veel hogere celdichtheden, bevatten geen exogene materialen, en kan geheel worden gemaakt van menselijke cellen en eiwitten. Vaattransplantaten gemaakt van menselijke cellen kan bereiken aanzienlijke mechanische sterkte in de afwezigheid van exogeen steigers (bv, barstdruk van 3400 mmHg vergeleken met 1600 mmHg voor de menselijke aderen) 12. Hoewel de cel-gebaseerde vaatweefsel vertonen een verbeterde cel-dichtheid en mechanische sterkte, de meeste huidige fabricage methoden (zoals 'sheet-gebaseerde engineering "3,4,12 of" bioprinting "5,13) vereisen een uitgebreide cultuur periodes (> 3 maanden) of gespecialiseerde apparatuur voor 3D weefsel bouw. De cel-afgeleide weefsel ring method hier beschreven maakt een snelle cellulaire zelf-assemblage tot robuuste 3D-weefsel constructies vormen binnen een korte tijd en zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur.
Dit protocol beschrijft de procedure die wij ontwikkeld om 2 mm binnendiameter rat gladde spiercellen afgeleide weefsel ringen te creëren. In het huidige voorbeeld werden gekweekt weefsel ringen voor 7 dagen (toen gekweekt voor een extra 7 dagen voor ring-fusion en buis vorming). Echter, 2 mm rat (en menselijke) gladde spiercel ringen kunnen worden verwijderd uit de putten en zijn samenhangend genoeg zijn voor de behandeling (bijvoorbeeld overdracht naar silicone buizen) al een dag na cel zaaien. Daarnaast kunnen robuuste weefsel ringen met verschillende diameters binnenste (2, 4 en 6 mm) worden gemaakt met deze methode door simpelweg het veranderen van de functie diameter van de oorspronkelijke polycarbonaat mal. 8 Onlangs hebben we ook het polycarbonaat matrijs ontwerp aangepast om vijf 2 mogelijk mm seeding putten te worden gegoten in een enkele multi-well agarose kamer, diegebruikt minder PDMS en agarose, en past in een putje van een 6-wells plaat (gegevens niet getoond). Veranderingen in de post diameter, de breedte van het zaaien goed, de straal van de kromming van de afgeronde bodem, kan het aantal putten zaaien, of de diepte van de putten alle zaaien eenvoudig worden aangepast door het veranderen van de specificaties in het CAD-bestand voor CNC bewerking van de polycarbonaat mal. Ten slotte kan een enkele mal polycarbonaat worden gebruikt om een onbeperkt aantal templates PDMS fabriceren, en elke PDMS template kan worden gereinigd, geautoclaveerd en hergebruikt tientallen keren.
In aanvulling op het veranderen van de grootte van het weefsel ringen, hebben we ringen van veel verschillende soorten cellen, waaronder: primaire rat SMC (Cell Applications, R354-05), primaire menselijke kransslagader SMC (Lonza, CC-2583), primaire humane dermale fibroblasten 11 (gulle gift van Dr George Pins, WPI Afdeling Biomedische Technologie), ratten longfibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192), en de mesenchymale stamcellen (Lonza, PT-2.501). Elk van deze celtypen aggregaten en contracten rond het centrum berichten weefsel ringen vormen, hoewel de cellulaire organisatie, de ECM samenstelling en mechanische eigenschappen van de constructen verschilt voor elke cel type. Het zaaien parameters voor elk celtype dient empirisch te worden bepaald op basis van de grootte van de cellen en hun vermogen te aggregeren. Daarom, terwijl dit systeem van het creëren van cel afkomstige weefsel ringen is uiterst veelzijdig, kan het protocol nodig kleine aanpassingen voor een optimale weefsel formatie met verschillende celtypen.
Tissue ring geometrie vergemakkelijkt het laden en beoordeling van weefsel eigenschappen van het materiaal door eenassige trekproeven, zoals beschreven. Er is ook aanzienlijke precedent voor het gebruik van bloedvat ring segmenten tot vasculaire krimp en fysiologische functie te meten. Voorlopige studies wijzen erop dat uit de cel afkomstige weefsel ringen kan worden gemonteerd op een draad myograph apparaat voor het meten van farmacologische responsiviteit encontractiele kracht generatie (gegevens niet getoond). Al met al, het vermogen om snel zelf-geassembleerde cel ringen fabriceren voor histologische, mechanische, fysiologische en biochemische analyse suggereert een krachtig nieuw instrument dat nuttig kan zijn voor het modelleren van vasculair weefsel structuur en functie in gezondheid en ziekte.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs dankbaar erkennen Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) voor zijn hulp bij het CNC-verspanen. Daarnaast willen we met Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) bedanken voor haar hulp met MATLAB programmeren, maar ook Kate Beverage en Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) voor hulp bij Camtasia. Sophie Burke en Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) verstrekte aanvullende video-opnamen. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R15 HL097332), de UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, de American Association Heart (undergraduate research fellowship aan JZH) en Worcester Polytechnic Institute (zomer Undergraduate Research Fellowship aan JZH en institutionele start-up fondsen MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
