Summary
В данной статье рассматривается универсальный метод для создания ячейки полученных кольца ткани сотовой самостоятельной сборки. Гладкие мышечные клетки посеяны в кольцевой агарозном скважин совокупности и контракт для формирования надежных трехмерных (3D) тканей в течение 7 дней. Миллиметрового масштаба кольца ткани способствуют механические испытания и служат в качестве строительных блоков для сборки ткани.
Abstract
Каждый год сотни тысяч пациентов проходят аортокоронарного шунтирования в США 1. Примерно треть этих пациентов нет подходящих доноров аутологичных судов из-за прогрессирования заболевания или предыдущего урожая. Цель сосудистой тканевой инженерии является разработка подходящего альтернативного источника для этих шунтов. Кроме того, разработаны сосудистой ткани могут оказаться полезными в качестве живых сосудистой модели для изучения сердечно-сосудистых заболеваний. Несколько перспективных подходов к судам инженерных крови были изучены, и многие недавние исследования с акцентом на развитие и анализа клеточных методов. 2-5 Здесь мы представляем метод быстро самоорганизуются клеток в 3D кольца ткань, которая может быть использована в пробирке для моделирования сосудистой ткани.
Чтобы сделать это, суспензии клеток гладкой мускулатуры высевают в круглым дном кольцевой агарозном скважин. Не-адгезионные свойства позволяют агарозном йэлектронной клетки на поселение, агрегировать и контракт вокруг поста в центре и сформировать сплоченную кольцо ткани. 6,7 Эти кольца можно культивировать в течение нескольких дней перед сбором урожая для механических, физиологических, биохимических, или гистологического анализа. Мы показали, что эти клеточные полученные кольца ткань выход на 100-500 кПа предел прочности на растяжение 8, которая превышает стоимость зарегистрированы и в других тканях инженерных конструкций сосудистых культивировали в течение аналогичного длительности (<30 кПа). 9,10 Наши результаты показывают, что надежная ячейка полученных сосудистой поколения кольцо ткани может быть достигнуто в течение короткого периода времени, и дает возможность для прямого и количественная оценка вклада клеток и клеточных производных матрицы (МЧР) в сосудистой структуры тканей и функции.
Protocol
1. Сотовые посева плесень изготовления
Начните с фрезерной 1 / 2 "толстый кусок поликарбоната для создания 15, с круглым дном, кольцевые скважин с диаметром центр пост 2 мм. Фрезерованные каналы 6 мм глубиной и 3,75 мм. Чистота и сухость форм поликарбоната удалите все пластиковые мусора из процесса фрезерования.
Смешайте полидиметилсилоксана (PDMS) в соотношении 10:1 (в / в) от базового до отвердителя, Дега, чтобы удалить все пузырьки воздуха, и вылейте на плесень поликарбоната. Дега снова, чтобы удалить все оставшиеся пузыри, и лечения в духовке при температуре 60 ° С в течение 4 часов.
После отверждения, аккуратно удалите шаблон PDMS медленным пилинг ее от поликарбоната, мыть с мылом и водой, и автоклав. Также автоклаве решение двух процентов агарозы (вес / объем), растворенные в модифицированной Eagle Дульбекко среде (DMEM).
Место шаблон PDMS на ровную поверхность и залить расплавленным ага выросла на первом пипетирования агарозы в каждую из форм центре пост, а затем пипеткой в пространство вокруг него. Разрешить агарозном закрепить (примерно 15 минут), затем инвертировать форму, чтобы освободить агарозы из PDMS. Сокращение избыточных агарозы со всего каждый из скважин, и место агарозном скважин в 12-луночных планшетах.
2. Культура клеток и кольцо посева
Добавить культуры клеток (DMEM с 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицин) вокруг внешней формы агарозы, без покрытия верхней части формы. Место пластин в инкубаторе и дать им возможность равновесие в течение примерно 15 минут, пока вы готовите клеток.
На 90% слияния, trypsinize крысы аорты гладкомышечных клеток (РСМЦ) и ресуспендируют в концентрации 5х10 6 кл / мл. Внесите 100 мкл клеточной суспензии в каждый из кольцевых агарозном скважин, используя круговые движения применять клетки в каждую лунку.
Содержание "> Убедитесь, что полки инкубатора уровне, то место плит в инкубаторе и дать им возможность спокойно сидеть в течение 24 часов. бирже средний каждые два дня, затем с помощью аспирационной средств массовой информации со всего хорошо, и повторное наполнение каждой лунки до агарозы и полностью погружен в воду.3. Ткань уборки кольцо и измерения толщины
В завершение культуры, снять кольцо из формы агарозы, сдвинув ее на верхнюю часть центра поста.
Место кольцо в маленькой чашке Петри с фосфатным буферным раствором (PBS), по центру образца, и приобрести образ с помощью цифровой системы визуализации.
Используйте программу для анализа изображений для определения краев и измерьте толщину кольца в 4 позиции (сверху, снизу, слева и справа) вокруг своей окружности. Рассчитать среднее значение толщины (т) для каждого отдельного кольца, и использовать это значение для вычисления площади поперечного сечения(2π (т / 2) 2).
4. Механические испытания колец
Настройка разрывной машине тестирования (EPS Instron 1000) в горизонтальном положении. Прикрепить 1N ± 1 млн тензодатчика и пользовательские тонкие ручки проволоку (созданные изгибе проволока из нержавеющей стали).
Гора Кольцо образца на две тонкие ручки проволоку. Расширение ручки до 5 млн. тары приложении нагрузки к образцу. Введите площадь поперечного сечения (рассчитывается по результатам измерения толщины) и записи базовой длины.
Предварительно цикла кольца в 8 раз между нагрузкой тары и 50 кПа напряжение при скорости 10 мм / мин. После восьмого предварительно цикла, потяните на провал в 10 мм / мин. Невыполнение отмечается как снижение силы на 40% из одного измерения в другое. Для каждого кольца образца, измерения предела прочности (ЕТС) и неспособность напряжение и рассчитать максимальную касательного модуля (MTM) из полученных данных.
5. Ткань кольцоsembly для изготовления тканей труб
Custom держатели трубки изготовлены из круглых 5 см диски поликарбоната с прямоугольными вырезами (2 см х 3 см). Дрель резьбовые отверстия с помощью этих дисков, чтобы позволить двум владельцам быть пьяным вместе. Автоклав пользовательских держателей трубы, а затем передать в кабинет биологической безопасности и место в пустую чашку Петри.
Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать концы 1,9 мм трубами диаметром силиконовые под углом к созданию скошенными краями, а затем автоклав силиконовых трубок. В то время как трубы в настоящее время в автоклаве, заполнить чашку Петри со СМИ.
Снимите кольца из агарозы скважин и поместить их в чашку Петри со СМИ. Место автоклавного силиконовых трубок в одной чашке Петри на влажную их перед использованием.
Используйте пинцет, чтобы место скошенный конец силиконовой трубки в центре кольца и аккуратно сдвиньте кольцо на силиконовой трубки. Повторите с желаемым числом пNGS. Слайд кольца в контакте друг с другом, осторожно подталкивая их последовательно в обоих направлениях вдоль трубы. Этот метод может быть использован для колец, забиваются в один день в культуре.
Как только кольца установлены, выровнять силиконовых трубок внутри держателей поликарбоната и винт две части держателя вместе. Место держатель 100 мм блюдо Петри и добавить 55 мл средства массовой информации. СМИ биржи каждые 3 дня в течение всего срока культуры.
Для удаления ткани труб, выпуск силиконовых трубок из держателя поликарбоната и использование щипцов, чтобы скользить ткани труб с силиконовой трубкой и в чашке Петри заполнены PBS.
6. Представитель Результаты:
Когда протокол выполняется правильно, клетки совокупности сформировать ткани колец с внутренним диаметром, равным диаметру соответствующей должности форму в течение 24 часов. Кольцо края, как правило, гладкие на вид и (если культурноред на ровной поверхности), являются однородными по толщине по всей окружности. Ткань кольца просты в обращении и могут быть удалены из их скважин для последующей механической и гистологический анализ (см., в Gwyther и соавт., 2011 8). Ткань кольцо морфологии, матрица состав и механические свойства изменяются в зависимости от количества и типа клетки заполнена.
Представитель результаты ткань кольца, изготовленные из различных типов клеток, посев условий и культуры длины приведены в таблице 1. Два мм кольца ID создан из 5x10 5 РСМЦ выставлены выше, чем ОТС кольца созданы из наших ранее опубликованных 2 мм кольца (из 6.6x10 5 РСМЦ) 8. Подобно крысе клетки, человеческие клетки гладкой мускулатуры (hSMC) легко объединить в форме ткани кольца, в котором содержится большое количество коллагена после всего лишь 14 дней в культуре (данные не представлены). Человеческих мезенхимальных стволовых клеток (hMSC) также собраны и сформировали сплоченную колец, но ла-cked механической прочностью и сломал во время начальной фазы precycling одноосного испытание на растяжение.
| н | Сотовый номер | Толщина (мм) | Длина культуры (дней) | ОТС (кПа) | MTM (кПа) | Отказ деформации (мм / мм) | |
| РСМЦ кольца | 6 | 660000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| РСМЦ кольца | 4 | 500000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| hSMC кольца | 3 | 750000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC кольца | 3 | 750000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Таблица 1. Таблица показывает культуру параметров и механических свойств 2 мм колец, порожденных из разных типов клеток, посев концентрации и культуры длительности.
Рисунок 1. () Схема процесса генерации кольцо ткани. (B) Особый поликарбоната плесень с фрезерованными кольцевой скважин. Центральный диаметров посте 2 мм. (C) PDMS шаблон после его очищенные от формы поликарбоната. (D) Агрегированный кольцо ткани культивировали в форме агарозы с 2 мм пост. (Е) Два мм диаметр кольца ткани в PBS. Шкала баров = 6 мм (В, С) и 2 мм (D, E).
Рисунок 2. Представитель участок кривой деформации произвоКНИ от одноосного тестирование на растяжение.
Discussion
В последнее время наблюдается повышенный интерес к клеточной или "строительные леса-менее" методы тканевой инженерии для решения некоторых из ограничений эшафот подходов, основанных на тканевой инженерии. Учитывая, что клетка полученные ткани, созданные из клеток и матрицей они производят, они по своей природе содержат гораздо более высокой плотности клетки, не содержащие экзогенные материалов, и могут быть изготовлены полностью из человеческих клеток и белков. Протезы сосудов из человеческих клеток может достичь существенной механической прочностью при отсутствии экзогенных лесов (например, взрыв давлением 3400 мм рт.ст. по сравнению с 1600 мм рт.ст. для человека подкожных вен) 12. Хотя клеточной сосудистой ткани выставку улучшения клеточной плотности и механической прочности, большинство современных методов производства (такие, как "лист основе техники" 3,4,12 или "bioprinting" 5,13) требуются длительные периоды времени в культуре (> 3 месяцев) или специализированное оборудование для строительства 3D ткани. Ячейки полученных тканей кольцом методамиод, описанные здесь позволяет быстро сотовой самосборки для формирования надежной конструкции 3D-ткани в течение короткого периода времени и без использования специального оборудования.
Этот протокол подробно процедура, разработанная нами для создания 2 мм внутреннего диаметра крысы гладкой мышечной клетки полученные кольца ткани. В настоящее время, например, ткань кольца культивировали в течение 7 дней (затем культивировали в течение дополнительных 7 дней для синтеза кольца и трубки образования). Тем не менее, 2 мм крысы (и человека) гладкие кольца мышечных клеток могут быть удалены из скважин и сплоченной достаточно для обработки (например, передача на силиконовых трубок) уже на следующий день после посева ячейки. Кроме того, прочная ткань кольца с различным внутренним диаметром (2, 4 и 6 мм) могут быть созданы с помощью этого метода, просто изменив сообщение диаметр оригинальной формы из поликарбоната. 8 Кроме того, мы недавно изменили дизайн поликарбоната плесень включить пять 2 мм посева скважин должны быть поданы в одном мульти-и агарозном камеры,использует меньше PDMS и агарозы, и вписывается в одну лунку 6-луночного планшета (данные не представлены). Изменения в штатном диаметре, ширина посева хорошо, радиус кривизны округлый низ, номер посева скважин, или глубина посева скважин могут быть изменены только путем изменения спецификаций в файл CAD для ЧПУ обработка форм поликарбоната. Наконец, единственной формы, поликарбонат может быть использован для изготовления неограниченное число шаблонов PDMS, и каждый шаблон PDMS могут быть очищены, автоклавного и повторно использовать в десятки раз.
В дополнение к изменению размера ткани кольца, мы сделали кольца из разных типов клеток, в том числе: первичный ГМК крысы (Cell приложения, R354-05), первичных человеческих коронарной артерии ГМК (Lonza, СС-2583), первичных человеческих кожных фибробластов 11 (щедрый подарок доктора Джорджа Pins, WPI кафедры биомедицинской инженерии), фибробластов легких у крыс (РКИ-6, АТСС CCL-192), и мезенхимальных стволовых клеток (Lonza, ПТ-2501). Каждый из этих типов клеток агрегатов и контракты вокруг центра сообщений для формирования тканей кольца, хотя клеточной организации, ECM состава и механических свойств конструкции изменяются для каждого типа клеток. Посев параметры для каждого типа клеток должны быть эмпирически определяется на основе размера клеток и их способность к агрегации. Поэтому, хотя эта система создания ячейки полученных кольца ткани чрезвычайно гибок, протокол может потребоваться некоторые коррективы для оптимального формирование ткани с различными типами клеток.
Геометрия тканей кольцо облегчает погрузку и оценки свойств тканевого материала при одноосном тестирования на разрыв, как описано. Существует также существенный прецедент для использования крови сегментов судна кольцо для измерения сосудистых сокращений и физиологические функции. Предварительные исследования показывают, что клетка полученные кольца ткани могут быть установлены на устройстве myograph провод для измерения фармакологической реакции исократительной формирование сил (данные не представлены). В целом, способность быстро изготовить самоорганизующихся кольца ячейки для гистологического, механические, физиологические и биохимические анализы предлагает новый мощный инструмент, который может быть полезным для моделирования сосудистой структуры тканей и функции в норме и патологии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Нил Уайтхаус (ИЗВ, Хиггинс Machine Shop) за его помощь в обработке CNC. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Адриана Гера (ИЗВ вычислений и связи Центр) за помощь в MATLAB программирования, а также напитки и Кейт Джозеф Cotnoir (ИЗВ Академический технический центр) за помощь в Camtasia. Софи Берк и Jacleen Беккер (WPI Академический технический центр), при условии дополнительного видеоматериалы. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья (R15 HL097332), Медицинской школы Университета Массачусетса-WPI Pilot Исследовательская инициатива, Американской ассоциации сердца (для студентов стипендию исследований JZH) и Вустер политехнического института (лето Бакалавриат стипендий для исследований JZH и институциональных стартовый капитал для MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
