Summary
Este artigo descreve um método versátil para criar anéis de células derivadas do tecido celular por auto-montagem. Células musculares lisas semeadas em forma de anel-agarose agregado poços e contrato de forma robusta em três dimensões (3D) tecidos dentro de 7 dias. Anéis milímetro escala de tecido são conducentes a testes mecânicos e servem como blocos de construção para a montagem dos tecidos.
Abstract
Cada ano, centenas de milhares de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização do miocárdio nos Estados Unidos 1. Aproximadamente um terço destes pacientes não têm adequado navios dadores autólogo devido à progressão da doença ou safra anterior. O objetivo da engenharia de tecidos vasculares é desenvolver uma fonte alternativa adequada para estas pontes. Além disso, o tecido vascular engenharia pode revelar-se útil como modelos vivos vascular para estudar doenças cardiovasculares. Várias abordagens promissoras para os vasos sanguíneos de engenharia têm sido exploradas, com muitos estudos recentes com foco no desenvolvimento e análise de métodos baseados em células. 2-5 Aqui, apresentamos um método para rapidamente auto-montar células em anéis de tecido 3D que pode ser usado em vitro para modelar os tecidos vasculares.
Para fazer isso, suspensões de células musculares lisas são semeados no fundo redondo de anular agarose poços. As propriedades não-adesivo do agarose permitem ªcélulas e para resolver, agregar e contrato em torno de um posto no centro do poço para formar um anel de tecido coeso. 6,7 Estes anéis podem ser cultivadas por vários dias antes da colheita para a mecânica, análise fisiológica, bioquímica ou histológica. Nós mostramos que estes anéis de células derivadas de tecidos de rendimentos na resistência à tração 100-500 kPa final 8, que excede o valor reportado para outras construções de tecido vascular engenharia cultivadas por períodos semelhantes (<kPa 30). 9,10 Nossos resultados demonstram que a célula robusta derivados de geração de anel vascular do tecido pode ser alcançada dentro de um curto período de tempo, e oferece a oportunidade para avaliação direta e quantitativa das contribuições de células e de células derivadas de matriz (MDL) para a estrutura do tecido vascular e função.
Protocol
1. Célula de fabricação de moldes semeadura
Começar por uma moagem 02/01 pedaço "de espessura de policarbonato para criar 15, de fundo redondo, poços anular com um diâmetro poste central de 2 mm. Os canais moídos são de 6 mm de profundidade e 3,75 milímetros de largura. Limpe e seque o molde de policarbonato para remover todos os detritos de plástico a partir do processo de moagem.
Mix polidimetilsiloxano (PDMS) na proporção 10:1 (w / w) de base para agente de cura, Degas para remover todas as bolhas de ar, e despeje no molde de policarbonato. Degas novamente para remover as bolhas restantes, e cura em estufa a 60 ° C por 4 horas.
Uma vez curado, remova cuidadosamente o modelo PDMS por lentamente descascando-lo longe do policarbonato, lave com água e sabão, e autoclave. Autoclave também uma solução de dois por cento agarose (w / v) dissolvido em Dulbecco modificado Eagle (DMEM).
Coloque o modelo PDMS sobre uma superfície plana e encher com aga fundido subiu pela primeira pipetagem agarose em cada um dos moldes pós-center, e depois de pipetagem para o espaço em torno dela. Permitir que a agarose para solidificar (cerca de 15 minutos), depois inverta o molde para liberar a agarose do PDMS. Cortar o excesso de agarose em torno de cada um dos poços, e colocar os poços de agarose em 12-lamelas.
2. Cultura de células e semeadura anel
Adicionar cultura de células de mídia (DMEM com 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina) em torno do exterior do molde agarose, sem cobrir a parte superior dos moldes. Coloque as placas na incubadora e permitir-lhes estabilizar durante cerca de 15 minutos enquanto você prepara as células.
Na confluência de 90%, trypsinize rat aorta células musculares lisas (rSMCs) e ressuspender em uma concentração de 5x10 6 células / ml. Pipetar 100 mL da suspensão de células em cada um dos poços de anular agarose, usando um movimento circular para aplicar as células em cada poço.
content "> Make prateleiras certeza incubadora são de nível, em seguida, coloque as placas na incubadora e permitir-lhes a sentar-se em repouso por 24 horas. meio de troca a cada dois dias depois, aspirando a mídia de todo o bem, e re-encher bem cada até o agarose bem é completamente submerso.3. Colheita de tecidos de toque e medidas de espessura
Na conclusão da cultura, remover o anel do molde agarose, deslizando-a sobre a parte superior do poste central.
Coloque o anel em uma pequena placa de Petri com tampão fosfato (PBS), o centro da amostra, e adquirir uma imagem usando um sistema de imagem digital.
Use um programa de análise de imagem para detecção de bordas e medir a espessura do anel em 4 posições (superior, inferior, direita e esquerda) em torno de sua circunferência. Calcular o valor de espessura média (t) para cada anel individual, e usar esse valor para calcular a área da seção transversal(2π (t / 2) 2).
4. Ensaios mecânicos de anéis
Configurar a máquina de ensaio de tração (Instron EPS 1000) na posição horizontal. Anexar uma célula de carga 1N ± 1mn e personalizados apertos fio fino (criado por flexão de arame de aço inoxidável).
Monte a amostra anel sobre os dois apertos de arame fino. Estender as garras até a 5 mN de carga de tara é aplicada à amostra. Entrar na área transversal (calculado a partir de medições de espessura) e gravar o tamanho calibre.
Pré-ciclo dos anéis 8 vezes entre a carga de tara e 50 kPa estresse a uma taxa de 10 mm / min. Após o oitavo pré-ciclo, retire a falha em 10 mm / min. Falha é observada como uma diminuição em vigor em 40% a partir de uma medição para outra. Para cada amostra de anel, medir a tensão de rotura (UTS) e tensão de falha e calcular o máximo tangente módulo (MTM) a partir dos dados adquiridos.
5. Anel de tecido comoassembléia para fabricar tubos de tecido
Suportes para tubos personalizadas são usinadas a partir de discos round 5 centímetros de policarbonato com recortes retangulares (2 cm x 3 cm). Faça furos com rosca através destes discos para permitir que dois titulares para ser aparafusada. Autoclave titulares tubo de costume, e depois transferir para o gabinete de biossegurança e colocar em uma placa de Petri vazia.
Use uma tesoura cirúrgica para cortar as extremidades dos tubos de silicone 1,9 milímetros de diâmetro em um ângulo para criar bordas chanfradas, e depois autoclave os tubos de silicone. Enquanto os tubos estão sendo autoclavado, preencher uma placa de Petri com meios de comunicação.
Remova os anéis dos poços agarose e colocá-los na placa de Petri com meios de comunicação. Coloque autoclavado tubos de silicone na mesma placa de Petri para molhar-los antes de usar.
Use uma pinça para colocar um fim chanfrado de um tubo de silicone para o centro de um anel e deslize o anel para o tubo de silicone. Repita com o número desejado de rings. Deslize os anéis em contato um com o outro delicadamente empurrá-los sucessivamente em ambas as direções ao longo do tubo. Este método pode ser usado para anéis colhidos depois de apenas um dia de cultura.
Uma vez que os anéis são montados, alinhar tubos de silicone dentro do parafuso titulares policarbonato e as duas partes do titular juntos. Coloque o suporte em 100 milímetros prato Petri e adicionar 55 mL de mídia. Troca de mídia a cada 3 dias para a duração da cultura.
Para remover os tubos de tecido, solte os tubos de silicone do detentor de policarbonato e utilize uma pinça para deslizar os tubos de tecido fora do tubo de silicone e em uma placa de Petri cheia de PBS.
6. Resultados representativos:
Quando o protocolo é realizado corretamente, as células agregadas para formar anéis de tecido com um diâmetro interno igual ao diâmetro do pino molde correspondente no prazo de 24 horas. As bordas do anel são geralmente liso na aparência e (se cultured em uma superfície plana), são uniformes em espessura em torno de toda a circunferência. Os anéis de tecido são de fácil manuseio e podem ser removidos de seus poços para análise mecânica e histológica subseqüente (ver na Gwyther et al., 2011 8). Morfologia do tecido de toque, composição da matriz, e propriedades mecânicas variam de acordo com o número eo tipo de células inoculadas.
Resultados representativos dos anéis de tecido feito de diferentes tipos de células, semeando as condições e duração da cultura são apresentados na Tabela 1. Dois anéis mm de diâmetro criados a partir de 5x10 5 rSMCs exibiu uma UTS superior anéis criados a partir de nosso previamente publicados dois anéis mm (feita a partir de 6.6x10 5 rSMCs) 8. Similares às células de rato, células do músculo liso (hSMC) prontamente agregadas para formar tecidos anéis, que continham uma grande quantidade de colágeno após apenas 14 dias em cultura (dados não mostrados). Células-tronco mesenquimais (hMSC) também agregados e anéis formados coesa, mas laforça cked mecânica e quebrou durante as fases iniciais de precycling testes de tração uniaxial.
| n | Número de células | Espessura (mm) | Comprimento da cultura (dias) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Tensão de falha (mm / mm) | |
| RSMC anéis | 6 | 660000 | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| RSMC anéis | 4 | 500000 | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| hSMC anéis | 3 | 750000 | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC anéis | 3 | 750000 | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabela 1. Tabela mostrando os parâmetros da cultura e propriedades mecânicas de dois anéis milímetros gerados a partir de diferentes tipos de células, as concentrações de semeadura, e durações cultura.
Figura 1. (A) Esquema do processo de geração de tecido do anel. (B) Custom molde de policarbonato com fresado poços anular. Diâmetros pós Central são 2 mm. (C) modelo PDMS depois de ter sido desfeito, a partir do molde de policarbonato. (D) anel de tecido agregados cultivadas em um molde de agarose com um posto de 2 mm. (E) anel de tecido Dois mm de diâmetro na PBS. Barra de escala = mm 6 mm (B, C) e 2 (D, E).
Figura 2. Enredo Representante da curva de tensão-produced do ensaio de tração uniaxial.
Discussion
Recentemente, tem havido um crescente interesse na célula-base ou "scaffold-less" métodos de engenharia de tecidos para tratar de algumas das limitações do andaime abordagens baseadas em engenharia de tecidos. Uma vez que células derivadas de tecidos são criados a partir de células e da matriz que produzem, eles inerentemente contêm densidades celulares muito maior, não contêm materiais exógenos, e pode ser feita inteiramente a partir de células humanas e proteínas. Enxertos vasculares feita a partir de células humanas podem atingir resistência mecânica substanciais na ausência de andaimes exógenas (por exemplo, pressões de ruptura 3400 mmHg em comparação a 1600 mmHg para veias safenas humanas) 12. Embora baseada em células de tecido vascular apresentam densidade celular melhorada e resistência mecânica, métodos de fabricação mais atuais (como "folha-base engenharia" 3,4,12 ou "bioprinting" 5,13) requerem períodos cultura extensa (> 3 meses) ou equipamentos especializados para a construção do tecido 3D. O anel de tecido derivadas de células-method descrito aqui permite rápida celulares auto-montagem para formar robusto constrói tecido 3D dentro de um curto período de tempo e sem o uso de equipamentos especializados.
Este protocolo detalha o procedimento foi desenvolvido para criar dois milímetros de diâmetro interior de ratos células derivadas do tecido do músculo liso anéis. No presente exemplo, os anéis de tecido foram cultivados por 7 dias (então cultivadas por mais sete dias para a fusão de anel e formação do tubo). No entanto, dois ratos mm (e humanos) anéis de células musculares lisas podem ser removidas dos poços e coesa o suficiente para o tratamento (por exemplo, transferir para tubos de silicone) tão cedo como um dia após a semeadura de células. Além disso, os anéis de tecido robusto com diferentes diâmetros internos (2, 4 e 6 mm) podem ser criadas com este método, simplesmente alterando o diâmetro post do molde de policarbonato original. 8 Nós também recentemente modificado o projeto de moldes de policarbonato para habilitar cinco dois milímetros poços semeadura para ser lançado em um único multi-câmara de agarose bem, o queusa menos PDMS e agarose, e se encaixa em um poço de uma placa de 6 poços (dados não mostrados). Alterações no diâmetro post, a largura da semeadura bem, o raio de curvatura da parte inferior arredondada, o número de poços de semeadura, ou a profundidade dos poços semeadura podem ser modificadas simplesmente mudando as especificações no arquivo CAD para CNC usinagem do molde de policarbonato. Finalmente, um molde de policarbonato único pode ser usado para fabricar um número ilimitado de modelos PDMS, e cada modelo PDMS podem ser limpos, autoclavados e reutilizados dezenas de vezes.
Além de alterar o tamanho dos anéis de tecido, fizemos anéis de muitos tipos de células diferentes, incluindo: SMCs rato primária (Applications Cell, R354-05), humanos primários SMCs arterial coronariana (Lonza, CC-2583), humanas primárias fibroblastos dérmicos 11 (dom generoso de Pinos Dr. George, WPI Departamento de Engenharia Biomédica), fibroblastos de pulmão de rato (RFL-6, ATCC CCL-192), e as células-tronco mesenquimais (Lonza, PT-2501). Cada um dos tipos de célula destes agregados e contratos em todo o posts centro para formar anéis de tecido, embora a organização celular, composição ECM, e propriedades mecânicas das construções variam para cada tipo de célula. Os parâmetros de semeadura para cada tipo de célula deve ser empiricamente determinada com base no tamanho das células e sua capacidade de agregar. Portanto, enquanto este sistema de criação de anéis de células derivadas de tecido é extremamente versátil, o protocolo pode precisar de pequenos ajustes para a formação de tecido ideal com diferentes tipos de células.
Geometria do anel de tecido facilita o carregamento fácil e avaliação das propriedades do material tecido por testes de tração uniaxial, conforme descrito. Há também precedentes substancial para o uso segmentos sangue anel navio para medir a contração vascular e função fisiológica. Estudos preliminares indicam que os anéis de células derivadas de tecido pode ser montado em um dispositivo myograph fio para a medição da capacidade de resposta farmacológica egeração de força contrátil (dados não mostrados). Ao todo, a capacidade de rapidamente fabricar anéis de auto-montagem de células para análise histológica, mecânicos, fisiológicos, bioquímicos e sugere uma nova e poderosa ferramenta que pode ser útil para a modelagem de estrutura do tecido vascular e função na saúde e na doença.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores agradecem Neil Whitehouse (WPI, Higgins Loja Machine) por sua ajuda com usinagem CNC. Além disso, gostaríamos de agradecer a Adriana Hera (WPI Computing e Communications Center) por sua ajuda com MATLAB programação, bem como bebidas e Kate Cotnoir Joseph (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia) para obter assistência com Camtasia. Sophie Burke e Jacleen Becker (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia), desde imagens de vídeo suplementar. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R15 HL097332), o UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, a American Heart Association (bolsa de pesquisa de graduação para JZH), e Instituto Politécnico de Worcester (Verão Bolsa de Investigação para JZH Graduação e institucionais start-up fundos para MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
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