In vitro-Montering av Semi-konstgjorda molekylär maskin och dess användning för detektion av DNA-skador

Summary

Vi visar montering och tillämpning av en molekylär skala enhet som drivs av en topoisomeras protein. Den konstruera är ett biomolekylära sensor som etiketter två huvudtyper av DNA-brott i vävnadssnitt genom att ansluta två olika fluoroforer till respektive sida.

Abstract

Naturligt förekommande bio-molekylära maskiner fungerar i varje levande cell och visa en mängd olika utföranden ^1-6. Men utvecklingen av konstgjorda molekylära maskiner fokuserar på anordningar som kan riktad rörelse, dvs molekylära motorer, och på deras förminskad mekaniska delar (hjul, axlar, hängen etc) ^7-9. Detta imiterar makro-maskiner, även om de fysiska egenskaperna avgörande för dessa enheter, såsom tröghet och fart bevarande, inte kan användas i nanoworld miljöer ^10. Alternativa utformningar, som inte följer den mekaniska macromachines system och använda mekanismer som utvecklats i utvecklingen av biologiska molekyler, kan dra nytta av de särskilda villkoren i nanoworld. Dessutom anpassar faktiska biologiska molekyler för tillämpningen av nano-design minskar potentiella faror nanoteknik produkterna kan medföra. Här kan vi visa på montering och tillämpning av en sådan bio-aktiverade konstruera, somEMI-konstgjorda molekylära enhet som kombinerar en naturligt förekommande molekylär maskin med konstgjorda delar. Från enzymologi synpunkt är vår konstruera en designer fluorescerande enzym-substrat komplex sätta ihop för att utföra en viss användbar funktion. Denna församling är per definition en molekylär maskin, eftersom det innehåller ett ^12. Men dess integration med de tekniska delen - leder åter till en ny uppgift för märkning DNA-skador ¹² - fluorescerande dubbla hårnål.

Vår konstruera monterar ur en 32-Mer DNA och ett enzym vaccinia topoisomeras I (VACC Friluftskartan). Maskinen använder sedan sitt eget material för att tillverka två fluorescerande detektor enheter (Figur 1). En av de enheter (grön fluorescens) bär VACC TOPO kovalent knutna till sina 3'end och en annan enhet (röd fluorescens) är ett fritt hårnål med en terminal 3'OH. Enheterna är kortlivade och snabbt montera tillbaka till den ursprungliga konstruktionen, som därefter recleaves.I avsaknad av DNA-brott dessa två enheter kontinuerligt separata och religate i en cyklisk sätt. I vävnadssnitt med DNA-skador, de topoisomeras-bär detektorenhet selektivt fäster trubbig slutade DNA bryter 5'OH (DNas II-typ raster) ^11,12, fluorescerande märkning dem. Den andra enzym-fri hårnål bildas efter oligonukleotid klyvning kommer ligate en 5'PO ₄ trubbig slutade paus (DNase I-typ raster) ^11,12, om T4 DNA-ligas är närvarande i lösningen ^13,14. När T4 DNA-ligas läggs till i en vävnad avsnitt eller en lösning innehållande DNA med 5'PO ₄ trubbig slutade bryter reagerar ligas med 5'PO ₄ DNA ändar, som bildar semi-stabilt enzym-DNA-komplex. Den trubbiga slutade hårnålar kommer att interagera med dessa komplex släppa ligas och kovalent länka hårnålar till DNA, vilket märkning 5'PO ₄ trubbig slutade DNA raster.

Denna utveckling är ett exempel på en ny praktisk inställning till the design av molekylära maskiner och ger en användbar för detektering av apoptos och DNA-skada i fasta celler och vävnader.

Protocol

Sektionerna för molekylär maskin-baserad detektering bör förberedas först, eftersom deras förberedelser tar längre tid än monteringen av molekylära enhet. Den konstruera fungerar bra med 5-6μm tjocka sektioner klippt från paraformaldehyd-fast, paraffininbäddade vävnadssnitt block. Använd bilden varumärken som behåller delar också, såsom ProbeOn Plus laddad och precleaned diabilder (Fisher Scientific) eller liknande. Vi rekommenderar till en början med hjälp av en vävnad med ett välkänt mönster av DNA-skador som innehåller både DNase I-och DNas II-typ raster, såsom dexametason-behandlade apoptotiska råtta bräss ^13,14.

1. Beredning av sektioner

1. Placera delarna i en bild rack och dewax i xylen i 15 min, överföring till en ny xylen bad i ytterligare 5 minuter.
2. Rehydrera genom att passera graderade etanol koncentrationer: 96% etanol-2x5min, 80% Etanol - 5min, vatten - 2x5 min.
3. Digest avsnitt med Proteinase K. Använd 100μL av en 50μg/mL lösning per avsnitt. Inkubera 15 'vid rumstemperatur (23 ° C) i en fuktig kammare. Tiden kan behöva justeras beroende på vävnadstyp. Hårda vävnader kan kräva längre matsmältningen. Gånger på 15-25 min normalt används. Otillräcklig matsmältning kan leda till att svagare signal. Overdigestion å andra sidan ger signalen försvinner och avsnitt störningar.
4. Skölj i destillerat vatten i 2x10 min.
5. Tillsätt 100 mikroliter per avsnitt på 2% BSA för preblocking. Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur (23 ° C). Under denna tid ihop molekylär maskin.

2. Molekylära maskiner montering

Alla reagenser skalas till 25 mikroliter totala volymen, vilket är tillräckligt för en enskild upptäckt i en medelstor vävnad avsnitt (10x10mm). Volymen kan skalas upp vid behov.

1. Kombinera med ett litet plaströr i denna ordning:

<tr>

Bidistilled vatten; 15% polyetylenglykol-8000; Lösning av 66 mm-Tris HCl, pH 7,5, 5 mm MgCl 2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mm ATP, (dvs. reguljära T4 DNA-ligas buffer); 70 pmoles av Oligonucleotide 1, 215 pmoles (från 1,76 till 7,1 mikrogram) VACC TOPO 10 enheter T4 DNA-ligas (500 U / ml)

2. Blanda varsamt genom att pipettera. Den molekylära konstruera nästan omedelbart själv monterar i denna lösning och kan användas direkt i rumstemperatur (23 ° C). Öka temperaturen till 37 ° C blockerar T4 DNA-ligas-baserad komponent av märkningen.

3. Använda molekylära maskiner i vävnadssnitt till dubbel etikett 5'OH och 5'PO4 DNA

1. Aspirera preblocking lösningen och tillämpa 25μL av hela reaktionsblandningen innehåller 70 pmoles av Oligonucleotide 1, från 53 till 215 pmoles (från 1,76 till 7,1 mikrogram) VACCFriluftskartan och 10 enheter T4 DNA-ligas (500 U / ml) i lösning 66 mm-Tris HCl, pH 7,5, 5mm MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mm ATP, och 15% polyetylenglykol-8000. Samma sekvens oligonukleotid bär på en enda FITC etikett, Oligonucleotide 2, kan användas istället för detektion av en enda typ av DNA-brott. I sådana fall utelämna ligas från märkningen reaktion. Även i denna situation en lösning av 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 15% PEG-8000 kan användas i stället för T4 DNA-ligas buffert.
2. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur (23 ° C) i en fuktig kammare med en plast täckglas. Skyddas mot ljus. Sänkning av temperaturen till 16 ° C minskar ligas-baserade signal; temperaturökningen till 37 ° C helt eliminerar ligas-baserade signal. En partiell hämning av ligas förekommer ibland i reaktionsblandningen, möjligen på grund av föroreningar introducerades med topoisomeras förberedelser. Därför kan längre inkubationstid (2-4 timmar) krävs speciellt när significant antal ligas märkt pauser är närvarande. Även om både ligas och signaler topografisk kan observeras i detta skede, i många fall ligas signalen kan förstärkas ytterligare genom att åter tillämpning av reaktionsblandningen utan VACC TOPO och dual-märkt Oligonucleotide, men innehåller en hårnål formad oligonukleotid (Oligonucleotide 3) (35 mg / ml) och T4 DNA-ligas (250 U / ml). För att förstärka signalen vidare till steg 3, för att se reaktionen utan förbättring gå till steg 5.
3. Ta bort täckglas genom att försiktigt sänka ner bilderna vertikalt i ett Coplin burk med vatten vid rumstemperatur. Aspirera överflödigt vatten.
4. Förbättra ligas signalen genom att tillämpa 25 mikroliter av reaktionsblandningen utan VACC TOPO och Oligonucleotide 1, men innehåller Oligonucleotide 3: 66 mm-Tris HCl, pH 7,5, 5 mm MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mm ATP, och 15%-polyetylenglykol- 8000, 5 enheter T4 DNA-ligas, 35 mg / ml Oligonucleotide 3 (trubbig slutade hårnål). Den totala volymen av märkning lösningen can skalas upp för att rymma större sektioner. Inkubera i 18 tim (över natten) i rumstemperatur (23 ° C) i en fuktig kammare med en plast täckglas.
5. Ta bort täckglas genom att försiktigt sänka ner bilderna vertikalt i Coplin burk innehåller vatten vid rumstemperatur. Tvätta sedan avsnitt 3x10 min i destillerat vatten.
6. Skölj med natriumbikarbonat buffert. Alkalisk lösning skölj förbättrar FITC fluorescens, som är pH-känsliga och har minskat avsevärt under pH 7.
7. Täck avsnitt med en antifading lösning (Vectashield med DAPI), täckglas och analysera signalen med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Double-DNA bryter med 5'OH kommer fluorescerar grönt, 5'PO ₄ raster - kommer fluorescera rött (Figur 2).

4. Representativa resultat

Figur 1. Semi-artificiell molekylär maskin upptäcker två typer avDNA-skador på plats. Den fluorescerande Maskinen själv monterar när VACC TOPO binder till den dubbla hårnålen 32-Mer. Maskinen börjar operationen genom att dela upp i två detektor enheter via topoisomeras-made skär i 3 'änden av erkännandet sekvensen. Detta resulterar i en cyklisk process där FITC-märkt enhet ständigt separerar och religates tillbaka till Rhodamine-märkta enheten. Det kvarstår tills en detekterbar DNA paus påträffas. När ett sådant alternativ acceptor (5'OH trubbiga änden DNA break) finns i vävnaden avsnitt kommer FITC delen ligate till det. Resterande Rhodamine delen kommer att lägga till 5 'PO ₄ DNA trubbiga änden bryts med hjälp av T4 DNA-ligas. Därför är båda typerna av DNA-brott samtidigt upptäcks.

Figur 2. Molekylär maskin dubbla etiketter två typer av DNA-brotti en vävnad avsnitt av dexametason behandlade bräss. Blunt-slutade DNA raster DNase I-och DNas II-typ upptäcks i thymic kortikala områden som genomgår apoptos. Grön cytoplasmisk fluorescens (5'OH DNA-brott) markerar kortikala makrofager smälta kärnämne på apoptotiska tymocyter. Denna signal är producerad av VACC Topo, och lokaliserar till phagolysosomes med DNA som innehåller 5'OH dubbla strängbrott ^11,12. Röd fluorescens (5'PO ₄ pauser) etiketter atomkärnor apoptotiska tymocyter inte uppslukas av makrofager. Massiva mängder tymocyter genomgår samtidigt apoptos åtföljas av generation 5'PO ₄ dubbel-strängbrott, visualiseras genom ligas-baserad märkning. Dessa pauser är belägna vid de kärntekniska periferin, som bildar ringformade mönster. Alla cellulära kärnor visualiseras genom motfärgning med DAPI (blå fluorescens).

Discussion

I den här videon visar vi hur du monterar och använder en dual-märkning sensor DNA-skador. Sensorn är en molekylär maskin som drivs av biomolekylära motor, ett virus-protein som bildas VACC TOPO samband med artificiella komponenter. De presenterade utvecklingen exemplifierar en bio-aktiverad synsätt som förespråkar att anpassa biologiska strukturer, arkitekturer och verkliga delar och komponenter av celler till utformningen av giftfria molekylär nivå enheter ^12,15. Detta synsätt löser två frågor inneboende till området för in vivo nanosensorer: 1. svårigheten att göra verkligt enhetliga och reproducerbara nano-konstruktioner genom att använda traditionella nanomaterial, och 2. Den potentiella toxiciteten och höga biologiska reaktivitet nanoprobes, partiklar och andra mycket spridda nanomaterial. Sensorn integrerar ett naturligt förekommande molekylär maskin med artificiella komponenter som åter styra den till en ny funktion av DNA-skador märkning. Produkten av en sådan integration är en se-mi-konstgjorda molekylära maskin riktad till en ny uppgift. Medan topoisomeras, polymeraser och andra enzymatiska maskiner används ofta i biokemisk forskning, de är inte integrerade med konstruerade komponenter till individuella molekylär församlingar. Därför i deras rutinmässig användning, de är inte anställda som semi-artificiella enheter ^12.

Här visar vi hur du använder sensorn i vävnaden avsnitt format för samtidig märkning av DNase I-och DNas II-typ raster. För närvarande finns det inga andra tillgängliga metoder för att utföra sådan samtidig dubbel detektion.

DNas I-och DNas II-typ pauser är viktiga markörer för celldöd progression, särskilt märkning apoptotiska själv autonoma och fagocytos faser ^11,16. Sensorn är ett bra komplement till biomedicinsk forskning arsenal arbetar med att upptäcka och detaljerad beskrivning av apoptos.