In vitro Montering af Semi-kunstige Molekylær Machine og dens anvendelse til påvisning af DNA-skader

Summary

Vi viser monteringen og anvendelsen af ​​en molekylær-skala-enhed drevet af en topoisomerase protein. Det begreb er en bio-molekylære sensor, som etiketter to store typer af DNA-brud i vævssnit ved at knytte to forskellige fluorophores til deres mål.

Abstract

Naturligt forekommende bio-molekylære maskiner arbejder i alle levende celler, og vise en lang række designs ^1-6. Men udviklingen af kunstige molekylære maskiner centre på enheder i stand til retningsbestemt bevægelse, dvs molekylære motorer, og på deres nedskaleret mekaniske dele (hjul, aksler, vedhæng osv.) ^7-9. Dette efterligner den makro-maskiner, selv om de fysiske egenskaber af afgørende betydning for disse enheder, såsom træghed og momentum bevarelse, der ikke kan benyttes i NanoWorld miljøer ^10. Alternative designs, som ikke følger de mekaniske macromachines ordninger og anvendelse af instrumenter udviklet i udviklingen af ​​biologiske molekyler, kan drage fordel af de særlige betingelser for NanoWorld. Desuden tilpasser faktiske biologiske molekyler med henblik på nano-design reducerer potentielle farer de nanoteknologiske produkter kan indebære. Her vil vi demonstrere samling og anvendelse af en sådan bio-aktiverede konstruktion, somEMI-kunstige molekylære enhed, som kombinerer en naturligt forekommende molekylære maskine med kunstige komponenter. Fra Enzymologi synspunkt, er vores konstruere en designer fluorescerende enzym-substrat kompleks sat sammen for at udføre en bestemt nyttig funktion. Denne samling er per definition en molekylær maskine, da det indeholder en ^12. Men dets integration med de konstruerede del - fluorescerende dobbelt hårnål - re-dirigerer den til en ny opgave med mærkning af DNA-skader ^12.

Vores konstruere samler ud af en 32-mer DNA og et enzym vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). Maskinen bruger derefter sit eget materiale til at fremstille to fluorescens-mærkede detektor enheder (figur 1). En af de enheder (grøn fluorescens) bærer VACC TOPO kovalent knyttet til sin 3'end og en anden enhed (rød fluorescens) er en gratis hårnål med en terminal 3'OH. Enhederne er kortvarige og hurtigt samle tilbage til den oprindelige konstruktion, der efterfølgende recleaves.I mangel af DNA brud disse to enheder kontinuerligt separate og religate i en cyklisk måde. I vævssnit med DNA-skader, topoisomerase-bærende detektoren selektivt tillægger stumpt-ended DNA bryder med 5'OH (DNase II-typen pauser), ^11,12, fluorescens mærkning dem. Den anden, enzym-fri hårnål dannet efter oligonukleotidet spaltning, vil ligate til en 5'PO ₄ stump-ended pause (DNase I-type pauser), ^11,12, hvis T4 DNA ligase er til stede i opløsningen ^13,14. Når T4 DNA ligase føjes til et væv sektion eller en opløsning, der indeholder DNA med 5'PO ₄ stumpe-ended pauser, de ligase reagerer med 5'PO ₄ DNA ender, danner semi-stabilt enzym-DNA komplekser. Den stumpe endte hårnåle vil interagere med disse komplekser slippe ligase og kovalent forbinder hårnåle til DNA, og dermed mærkning 5'PO ₄ stump-ended DNA pauser.

Denne udvikling er et eksempel på en ny praktisk tilgang til the design af molekylære maskiner og giver et nyttigt sensor til påvisning af apoptose og DNA-skader i faste celler og væv.

Protocol

Afsnittene for den molekylære maskine-baseret detektion bør udarbejdes først, fordi deres forberedelse tager længere tid end den samling af den molekylære enhed. De konstruerer fungerer godt med 5-6μm tykke sektioner skæres fra paraformaldehyd-fast, paraffinindstøbt væv blokke. Brug slide mærker, som bevarer sektioner godt, som f.eks ProbeOn Plus opladet og precleaned slides (Fisher Scientific) eller lignende. Vi anbefaler først at bruge en væv med en velkendt mønster af DNA-skader, som indeholder både DNase I-og DNase II-typen pauser, såsom dexamethason-behandlet apoptotiske rotte brissel ^13,14.

1. Udarbejdelse af sektioner

1. Placer sektioner i et dias rack og dewax i xylen i 15 min, overførsel til en frisk xylen bad i yderligere 5 minutter.
2. Rehydrere ved at passere gennem sorteres ethanol koncentrationer: 96% Ethanol-2x5min, 80% Ethanol - 5min, vand - 2x5 min.
3. Digest sektion med Proteinase K. Brug 100μL af en 50μg/mL opløsning pr sektion. Inkuber 15 'ved stuetemperatur (23 ° C) i et befugtet kammer. Den tid kan have brug for justering afhængig af vævstype. Hårde væv kan kræve længere fordøjelse. Gange på 15-25 min er normalt anvendes. Utilstrækkelig fordøjelse kan resultere i de svagere signal. Overdigestion på den anden side giver signal forsvinder, og § forstyrrelser.
4. Skyl i destilleret vand i 2x10 min.
5. Anvende 100 μL pr afsnit på 2% BSA preblocking. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur (23 ° C). I denne periode samle den molekylære maskine.

2. Molekylære maskiner samling

Alle reagenser er skaleret til 25 μL samlede volumen, hvilket er tilstrækkeligt til en enkelt detektion i en gennemsnitlig størrelse vævssnit (10x10mm). Lydstyrken kan skaleres op efter behov.

1. Kombiner i et lille plastikrør i denne rækkefølge:

<tr>

Bidistilled vand; 15% polyethylenglycol-8000; Løsning af 66 mM-Tris HCl, pH 7,5, 5 mm MgCl 2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, (dvs. regelmæssig T4 DNA ligase buffer); 70 pmoles af Oligonucleotid 1, 215 pmoles (1,76 til 7,1 mg) VACC TOPO 10 enheder T4 DNA ligase (500 U / ml)

2. Bland forsigtigt ved pipettering. Den molekylære konstruere næsten øjeblikkeligt selv samler i denne løsning og kan bruges med det samme ved stuetemperatur (23 ° C). Forøgelse af temperaturen til 37 ° C blokerer T4 DNA ligase-baserede del af mærkningen.

3. Brug af molekylære maskiner i vævssnit til dobbelt mærke 5'OH og 5'PO4 DNA pauser

1. Aspirer den preblocking løsningen og anvende 25μL af den fulde reaktionsblandingen indeholder 70 pmoles af Oligonucleotid 1, 53 til 215 pmoles (1,76 til 7,1 mg) VACCTOPO og 10 enheder T4 DNA ligase (500 U / ml) i løsningen af 66 mM Tris HCl, pH 7,5, 5mm MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, og 15% polyethylenglycol-8000. Den samme sekvens oligonukleotid med et enkelt FITC etiket, Oligonucleotid 2, kan anvendes i stedet for påvisning af en enkelt type af DNA pauser. I så fald udelade ligase fra mærknings-reaktion. Også i denne situation en opløsning af 50mM Tris-HCl, pH 7,4, 15% PEG-8000 kan bruges i stedet for T4 DNA ligase buffer.
2. Inkuber 1 time ved stuetemperatur (23 ° C) i et befugtet kammer med en plastik dækglas. Beskyttes mod lys. Sænkning af temperaturen til 16 ° C reducerer ligase-baserede signal, at temperaturen stiger til 37 ° C helt eliminerer ligase-baserede signal. En delvis hæmning af ligase nogle gange sker i reaktionsblandingen, muligvis på grund af forurenende stoffer indføres med topoisomerase præparater. Derfor kan længere inkubationstid (2-4 timer) være nødvendig, især når significant antal ligase-mærket pauser er til stede. Selv om både ligase og TOPO signaler kan observeres på dette stadium, i mange tilfælde ligase signalet kan blive yderligere forstærket af ny anvendelse af reaktionsblandingen uden VACC TOPO og dual-mærket Oligonucleotid, men som indeholder en hårnål formet oligonukleotid (Oligonucleotid 3) (35 mg / ml) og T4 DNA ligase (250 U / ml). For at forbedre signalet videre til trin 3, for at se reaktionen uden ekstraudstyr gå til trin 5.
3. Fjern dækglas ved forsigtigt at nedsænke objektglassene lodret i en Coplin krukke indeholdende vand ved stuetemperatur. Aspirer overskydende vand.
4. Forbedre ligase signal ved at anvende 25 μL af reaktionsblanding uden VACC TOPO og Oligonucleotid 1, men som indeholder Oligonucleotid 3: 66 mm-Tris HCl, pH 7,5, 5 mm MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, og 15% polyethylenglycol- 8000, 5 enheder T4 DNA ligase, 35 mg / ml Oligonucleotid 3 (afstumpede endte hårnål). Den samlede volumen af ​​mærkning løsningen CAn være skaleres op til at rumme større sektioner. Inkubér i 18 HR (natten) ved stuetemperatur (23 ° C) i et befugtet kammer med en plastik dækglas.
5. Fjern dækglas ved forsigtigt at nedsænke objektglassene lodret i Coplin krukke indeholdende vand ved stuetemperatur. Vask derefter sektion 3x10 min i destilleret vand.
6. Skyl med natriumbikarbonat buffer. Alkalisk opløsning skylles øger FITC fluorescens, som er pH-følsomme, og reduceres betydeligt lavere end pH 7.
7. Cover sektion med en antifading opløsning (Vectashield med DAPI), dækglas og analysere signalet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Dobbelt-streng DNA bryder med 5'OH vil fluorescerer grønt, 5'PO _{4 Pauser} - vil fluorescerer rødt (Figur 2).

4. Repræsentative resultater

Figur 1. Semi-kunstige molekylære maskinen registrerer to typer afDNA-skader in situ. Den fluorescerende maskinen selv samler, når VACC TOPO bindes til dobbelt-hårnål 32-Mer. Maskinen starter driften ved at splitte sig i to detektor enheder via topoisomerase-made skåret i 3 'enden af ​​anerkendelse sekvens. Dette resulterer i en cyklisk proces, hvor den FITC-mærkede enhed kontinuerligt adskiller og religates tilbage til rhodamine-mærkede enhed. Dette fortsætter, indtil en påviselig DNA pause er stødt på. Når en sådan alternativ acceptor (5'OH afstumpede ende DNA-brud) er til stede i vævet afsnit vil den FITC del ligate til det. Den resterende rhodamine del vil lægge til 5 'PO ₄ DNA-stump ende bryder med hjælp fra T4 DNA ligase. Derfor er begge typer af DNA-brud samtidigt opdaget.

Figur 2. Molekylær maskine dual etiketter to typer af DNA-brudi et væv afsnit af dexamethason-behandlet brissel. Blunt-ended DNA pauser DNase I-og DNase II-typen er fundet i thymus kortikale områder, der undergår apoptose. Grøn cytoplasmatisk fluorescens (5'OH DNA pauser) markerer kortikale makrofager fordøje nukleart materiale af apoptotiske thymocytter. Dette signal er produceret af VACC TOPO, og lokaliserer til phagolysosomes med DNA indeholder 5'OH dobbelt-strenget pauser ^11,12. Red fluorescens (5'PO _{4 Pauser)} etiketter kerner af apoptotiske thymocytter ikke opslugt af makrofager. Massive antal thymocytter samtidig undergår apoptose ledsages af en generation af 5'PO ₄ dobbelt-strenget pauser, visualiseret ved ligase-baserede mærkning. Disse pauser er placeret på det nukleare periferien, danner ringformede mønstre. Alle cellulære kerner er visualiseres ved kontrastfarvning med DAPI (blå fluorescens).

Discussion

I denne video viser vi hvordan man samler og bruger en dual-mærkning af DNA-skader sensoren. Sensoren er en molekylær maskine, drevet af bio-molekylære motorer, en virus-kodet protein VACC TOPO forbundet med kunstige komponenter. Den præsenterede udvikling eksemplificerer en bio-aktiveret strategi, der går tilpasse biologiske strukturer, arkitekturer og faktiske dele og komponenter af celler til design af ikke-giftige molekylære skala enheder ^12,15. Denne tilgang løser to problemer forbundet med inden for in vivo nanosensorer: 1. det er vanskeligt at gøre virkelig ensartet og reproducerbar nano-konstruerer ved hjælp af traditionelle nanomaterialer, og 2. potentielle toksicitet og høj biologisk reaktivitet af Måleproberne, partikler og andre højt-spredt nanomaterialer. Sensoren integrerer en naturligt forekommende molekylære maskine med kunstige komponenter som omdirigere det til en ny funktion af DNA-skader mærkning. Produktet af en sådan integration er en SEmi-kunstige molekylære maskine målrettet til en ny opgave. Mens topoisomeraser, polymeraser og andre enzymatiske maskiner ofte anvendes i biokemisk forskning, bliver de ikke integreret med konstruerede komponenter til individuelle molekylære forsamlinger. Dermed i deres rutinemæssige brug, er de ikke ansat som semi-kunstige enheder ^12.

Her viser vi, hvordan du bruger sensor i vævssnit format til samtidig mærkning af DNase I-og DNase II-typen pauser. I øjeblikket findes der ikke andre metoder til rådighed til at udføre sådanne samtidige dobbelt detektion.

DNase I-og DNase II-typen pauser er vigtige markører for celledød progression, specielt mærkning af apoptotiske selv-autonome og fagocytotisk faser ^11,16. Sensoren er et nyttigt supplement til det biomedicinske forskning arsenal beskæftiger sig med påvisning og detaljeret karakterisering af apoptose.