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Bioengineering

अर्द्ध कृत्रिम आण्विक मशीन और इसके उपयोग के डीएनए नुकसान की जांच के लिए इन विट्रो विधानसभा में

Published: January 11, 2012 doi: 10.3791/3628
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine, 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

हम विधानसभा और एक आणविक पैमाने पर एक topoisomerase प्रोटीन द्वारा संचालित डिवाइस के आवेदन को प्रदर्शित करता है. का निर्माण एक जैव आणविक सेंसर है जो उनके सिरों के लिए दो अलग अलग fluorophores संलग्न द्वारा ऊतक वर्गों में डीएनए टूट की दो प्रमुख प्रकार लेबल है.

Protocol

मशीन आधारित आणविक पता लगाने के लिए वर्गों पहले तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि उनकी तैयारी आणविक डिवाइस के विधानसभा से अधिक समय लेता है. का निर्माण 5-6μm मोटी paraformaldehyde तय, आयल एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक से काट वर्गों के साथ अच्छी तरह से काम करता है. स्लाइड ProbeOn प्लस चार्ज और precleaned स्लाइड्स (फिशर साइंटिफिक) या इसी तरह के रूप में जो वर्गों में अच्छी तरह से बनाए रखने के ब्रांड, का प्रयोग करें. हम पहले डीएनए की क्षति के एक प्रसिद्ध dexamethasone का इलाज apoptotic चूहे 13,14 थाइमस के रूप में जो दोनों DNase मैं और DNase-II प्रकार टूट शामिल पैटर्न के साथ एक ऊतक का उपयोग की सलाह देते हैं.

1. वर्गों की तैयारी

  1. एक स्लाइड और 15 मिनट के लिए xylene में रैक dewax में वर्गों रखें, एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए एक ताजा xylene स्नान करने के लिए स्थानांतरण.
  2. वर्गीकृत इथेनॉल सांद्रता के माध्यम से गुजर द्वारा rehydrate: 96% इथेनॉल - 2x5min, 80% इथेनॉल - 5min, पानी - 2x5 मिनट.
  3. Proteinas साथ डाइजेस्ट अनुभागई लालकृष्ण अनुभाग प्रति 50μg/mL समाधान के 100μL का प्रयोग करें. 15 सेते एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर. समय ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. हार्ड ऊतकों अब पाचन की आवश्यकता हो सकती है. 15-25 मिनट के टाइम्स आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है. अपर्याप्त पाचन कमजोर संकेत में परिणाम सकता है. संकेत लापता होने और अनुभाग व्यवधान में दूसरे हाथ परिणामों पर Overdigestion.
  4. 2x10 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला.
  5. Preblocking के लिए 100 μL 2% BSA के प्रति खंड लागू करें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट (23 डिग्री सी) के लिए सेते हैं. इस समय के दौरान आणविक मशीन इकट्ठा.

2. आणविक मशीनों विधानसभा

सभी अभिकर्मकों 25 μL कुल मात्रा है, जो एक औसत आकार के ऊतक अनुभाग (10x10mm) में एक एकल पता लगाने के लिए पर्याप्त है के लिए पहुंचा रहे हैं. मात्रा को बढ़ाया जा सकता है के रूप में की जरूरत है.

  1. इस क्रम में एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब में कम्बाइन:
<tr>
  1. Bidistilled पानी;
  2. 15% polyethylene glycol-8000;
  3. 66 के समाधान MM-Tris एचसीएल, 7.5 पीएच, 5 मिमी 2 MgCl, 0.1 मिमी dithioerythritol, 1 मिमी एटीपी (यानी नियमित रूप से टी -4 डीएनए ligase बफर );
  4. 1 Oligonucleotide के 70 pmoles,
  5. 215 (1.76 - 7,1 μg) pmoles Vacc Topo
  6. 10 इकाइयों टी -4 डीएनए ligase (500 यू / एमएल)
  1. Pipetting द्वारा धीरे मिलाएं. इस समाधान में लगभग स्वयं assembles तुरन्त आणविक निर्माण और तुरंत कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर इस्तेमाल किया जा सकता है. 37 तक तापमान बढ़ाने डिग्री सेल्सियस ब्लॉक लेबलिंग टी -4 डीएनए ligase आधारित घटक है.

3. दोहरी लेबल 5'OH और 5'PO4 डीएनए को तोड़ता है ऊतक वर्गों में आणविक मशीनों का उपयोग करना

  1. Preblocking समाधान महाप्राण (व्यंजन) और पूर्ण प्रतिक्रिया 1 Oligonucleotide के 70 pmoles, 53 युक्त मिश्रण के 25μL लागू - 215 (1.76 - 7,1 μg) pmoles VaccTopo और 10 इकाइयों को 66 MM-Tris एचसीएल, 7.5 पीएच, 5mm MgCl 2, 0.1 मिमी dithioerythritol, 1 मिमी एटीपी, और 15% polyethylene glycol 8000 के समाधान में टी -4 डीएनए ligase (500 यू / एमएल) . इसी अनुक्रम एक एकल FITC लेबल, 2 Oligonucleotide ले जाने oligonucleotide, डीएनए को तोड़ता का एक प्रकार का पता लगाने के के लिए बजाय प्रयोग किया जा सकता है. ऐसे मामले में लेबलिंग प्रतिक्रिया से ligase छोड़ देते हैं. इसके अलावा इस स्थिति में 15% खूंटी आठ हज़ार 50mm Tris - एचसीएल, 7.4 पीएच, एक समाधान टी -4 डीएनए ligase बफर के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर एक प्लास्टिक coverslip के साथ एक humidified कक्ष में 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्रकाश से सुरक्षित रखें. तापमान के 16 से कम ° सी ligase - आधारित संकेत कम कर देता है, तापमान 37 को बढ़ाने के लिए डिग्री सेल्सियस पूरी तरह से संकेत ligase आधारित समाप्त है. Ligase के एक आंशिक निषेध कभी कभी प्रतिक्रिया मिश्रण में होता है, संभवतः topoisomerase तैयारी के साथ शुरू contaminants के लिए कारण. इसलिए, अब ऊष्मायन (2-4 घंटे) की आवश्यकता हो सकता है विशेष रूप से है जबligase लेबल टूट की ignificant संख्या में मौजूद हैं. हालांकि दोनों ligase और topo संकेतों इस स्तर पर मनाया जा सकता है कई मामलों में ligase संकेत प्रतिक्रिया मिश्रण के आवेदन के द्वारा आगे बढ़ाया Vacc Topo और दोहरे लेबल Oligonucleotide के बिना हो सकता है, लेकिन कर सकते हैं एक बाल के लिये कांटा आकार oligonucleotide (3 Oligonucleotide) युक्त (35 मिलीग्राम / एमएल) और टी -4 डीएनए ligase (250 यू / एमएल). बढ़ाने के लिए संकेत करने के लिए चरण 3 आगे बढ़ना है, वृद्धि के बिना प्रतिक्रिया देखने के लिए चरण 5 पर जाएँ.
  3. धीरे स्लाइड्स Coplin जार युक्त कमरे के तापमान पर पानी में डुबो खड़ी करके coverslips निकालें. अतिरिक्त पानी महाप्राण (व्यंजन).
  4. Vacc Topo और एक Oligonucleotide के बिना प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 μL लागू है, लेकिन Oligonucleotide युक्त 3 ligase संकेत बढ़ाएँ: 66-मिमी Tris एचसीएल, 7.5 पीएच, 5 मिमी 2 MgCl, 0.1 मिमी dithioerythritol, 1 मिमी एटीपी, और 15% polyethylene glycol 8000, 5 इकाइयों टी -4 डीएनए ligase, 35 मिलीग्राम / एमएल 3 Oligonucleotide (कुंद समाप्त बाल के लिये कांटा). लेबलिंग समाधान ca की कुल मात्रापता बढ़ाया बड़ा वर्गों को समायोजित. कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर 18 घंटा (रातोंरात) के लिए एक प्लास्टिक coverslip के साथ एक humidified कक्ष में सेते हैं.
  5. धीरे स्लाइड Coplin कमरे के तापमान पर पानी युक्त जार में खड़ी डुबो coverslips निकालें. तब अनुभाग आसुत जल में 3x10 मिनट धोने.
  6. सोडियम बिकारबोनिट बफर के साथ कुल्ला. Alkaline समाधान कुल्ला FITC प्रतिदीप्ति, जो पीएच संवेदनशील है और 7 पीएच नीचे काफी कम है बढ़ाता है.
  7. खंड एक antifading (DAPI साथ Vectashield) समाधान, coverslip के साथ कवर और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन संकेत का उपयोग का विश्लेषण. डबल भूग्रस्त 5'OH के साथ डीएनए को तोड़ता है हरे, 5'PO 4 टूटता प्रतिदीप्ति - लाल (चित्रा 2) प्रतिदीप्ति जाएगा .

4. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2.
चित्रा 1 अर्द्ध कृत्रिम आणविक मशीन दो के प्रकार का पता लगाता हैबगल में डीएनए की क्षति. फ्लोरोसेंट मशीन स्वयं असेंबल जब Vacc Topo डबल बाल के लिये कांटा 32 पूर्व बांध. मशीन ही बंटवारे से आपरेशन शुरू होता है के माध्यम से दो डिटेक्टर इकाइयों में topoisomerase बनाया मान्यता अनुक्रम के 3 'अंत में कटौती है. एक चक्रीय प्रक्रिया है जहां इकाई FITC लेबल लगातार अलग और वापस rhodamine-लेबल इकाई religates में यह परिणाम है. यह बनी रहती है जब तक एक detectable डीएनए विराम का सामना करना पड़ा है. जब में एक वैकल्पिक स्वीकर्ता (5'OH कुंद अंत डीएनए को तोड़ने) ऊतक खंड में मौजूद है, FITC हिस्सा कटी घमनी को बांधना होगा. शेष rhodamine भाग 5 'पीओ टी -4 डीएनए ligase की मदद से 4 डीएनए कुंद अंत टूटता करने के लिए देते हैं जाएगा. नतीजतन, दोनों प्रकार के डीएनए को तोड़ता है एक साथ पता चला रहे हैं.

चित्रा 1.

चित्रा 2. आण्विक मशीन दोहरी डीएनए टूट की दो प्रकार के लेबलdexamethasone का इलाज thymus के एक ऊतक अनुभाग में. ब्लंट समाप्त DNase के डीएनए को तोड़ता है मैं और द्वितीय प्रकार DNase thymic cortical apoptosis के दौर से गुजर क्षेत्रों में पाया जाता है. ग्रीन cytoplasmic प्रतिदीप्ति (5'OH डीएनए को तोड़ता है) cortical मैक्रोफेज apoptotic thymocytes की परमाणु सामग्री को पचाने के निशान. यह संकेत Vacc Topo द्वारा निर्मित है, और 5'OH डबल भूग्रस्त टूटता 11,12 युक्त डीएनए के साथ phagolysosomes करने के लिए localizes है. लाल (5'PO 4 टूटता) apoptotic मैक्रोफेज द्वारा engulfed thymocytes के लेबल नाभिक प्रतिदीप्ति. Thymocytes का असीम संख्या एक साथ 5'PO 4 डबल भूग्रस्त टूटता है की पीढ़ी के साथ apoptosis से गुजरना, ligase - आधारित लेबलिंग द्वारा visualized. इन टूटता परमाणु परिधि में स्थित हैं, अंगूठी के आकार का पैटर्न के गठन. सभी सेलुलर नाभिक DAPI (नीला प्रतिदीप्ति) के साथ counterstaining द्वारा कल्पना कर रहे हैं.

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Discussion

इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे इकट्ठा और एक लेबलिंग दोहरी डीएनए की क्षति सेंसर का उपयोग करें. सेंसर एक आणविक जैव आणविक इंजन, एक प्रोटीन वायरस इनकोडिंग Vacc कृत्रिम घटकों के साथ जुड़ा हुआ Topo द्वारा संचालित मशीन है. प्रस्तुत विकास जैव सक्रिय दृष्टिकोण है जो जैविक संरचनाओं, आर्किटेक्चर और कक्षों की वास्तविक भागों और घटकों गैर विषैले आणविक पैमाने 12,15 उपकरणों के डिजाइन के लिए आदत डाल अधिवक्ताओं मिसाल है. यह दृष्टिकोण दो vivo nanosensors में के क्षेत्र में निहित मुद्दों को हल: 1 . पारंपरिक nanomaterials का उपयोग करके वास्तव में वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नैनो constructs बनाने की कठिनाई है, और 2. संभावित विषाक्तता, और nanoprobes, कण, और अन्य उच्च छितरी nanomaterials के उच्च जैविक जेट. सेंसर जो डीएनए की क्षति लेबलिंग का एक नया कार्य करने के लिए फिर से प्रत्यक्ष कृत्रिम घटकों के साथ स्वाभाविक रूप से घटनेवाला आणविक मशीन एकीकृत करता है. इस तरह के एकीकरण के उत्पाद एक से हैमील - कृत्रिम आणविक मशीन एक नया कार्य करने के लिए लक्षित है. जबकि टोपोईसोमेरासिज़, पीसीआर और अन्य एंजाइमी मशीनों जैव रासायनिक अनुसंधान में अक्सर इस्तेमाल किया जाता है, वे व्यक्तिगत आणविक विधानसभाओं में इंजीनियर घटकों के साथ एकीकृत नहीं कर रहे हैं. उनकी दिनचर्या का उपयोग नतीजतन, वे अर्द्ध कृत्रिम 12 उपकरणों के रूप में नियोजित नहीं कर रहे हैं .

यहां हम बताते हैं कैसे ऊतक अनुभाग प्रारूप में DNase के साथ - साथ लेबलिंग मैं और DNase टूटता द्वितीय प्रकार के लिए सेंसर का उपयोग करने के लिए. वर्तमान में वहाँ कोई अन्य ऐसे एक साथ दोहरी पता लगाने के प्रदर्शन के लिए उपलब्ध तरीके हैं.

DNase मैं और DNase-II प्रकार टूट कोशिका मृत्यु प्रगति के महत्वपूर्ण मार्करों हैं, विशेष रूप से apoptotic स्वयं स्वायत्त और phagocytic 11,16 चरणों लेबलिंग. सेंसर जैव चिकित्सा अनुसंधान का पता लगाने और apoptosis की विस्तृत विशेषताओं के साथ निपटने के शस्त्रागार के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध R01NS062842 अनुदान द्वारा मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (VVD) से और स्नायविक विकारों और स्ट्रोक ARRA के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (VVD) और R21 के राष्ट्रीय संस्थान से NS064403 R21 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया EB006301 बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान, स्वास्थ्य (VVD) के राष्ट्रीय संस्थानों.

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बायोइन्जिनियरिंग 59 अंक आणविक मशीन जैव नैनो 5'OH डीएनए को तोड़ता है 5'PO4 डीएनए को तोड़ता है सीटू का पता लगाने में apoptosis लेबलिंग चेचक topoisomerase मैं डीएनए को तोड़ता है हरी नैनो
अर्द्ध कृत्रिम आण्विक मशीन और इसके उपयोग के डीएनए नुकसान की जांच के <em>लिए इन</em> विट्रो <em>विधानसभा</em> में
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Minchew, C. L., Didenko, V. V.… More

Minchew, C. L., Didenko, V. V. In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage. J. Vis. Exp. (59), e3628, doi:10.3791/3628 (2012).

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