In vitro Montering av Semi-kunstig Molecular Machine og dens bruk for påvisning av DNA Damage

Summary

Vi viser montering og anvendelse av en molekylær skala enhet drevet av en topoisomerase protein. Den konstruere er en bio-molekylær sensor hvilke etiketter to hovedtyper av DNA brudd i vev seksjoner ved å feste to forskjellige fluorophores til sine formål.

Abstract

Naturlig forekommende bio-molekylære maskiner arbeid i hver levende celle og vise en rekke design ^1-6. Men utviklingen av kunstige molekylære maskiner sentre på enheter i stand til retningsbestemt bevegelse, dvs. molekylære motorer, og på deres nedskalert mekaniske deler (hjul, aksler, smykker etc) ^7-9. Dette imiterer makro-maskiner, selv om de fysiske egenskapene avgjørende for disse enhetene, som treghet og momentum bevaring, er ikke brukbare i nanoworld miljøer ^10. Alternative designs, som ikke følger mekaniske macromachines ordninger og bruk mekanismer utviklet i evolusjonen av biologiske molekyler, kan dra nytte av de konkrete forholdene i nanoworld. Dessuten tilpasser faktiske biologiske molekyler i forbindelse med nano-design reduserer potensielle farer nanoteknologi produktene kan utgjøre. Her kan vi demonstrere montering og anvendelse av en slik bio-aktivert konstruere, somEMI-kunstig molekylær enhet som kombinerer en naturlig forekommende molekylær maskin med kunstig komponenter. Fra enzymologi synspunkt, er vår konstruere en designer fluorescerende enzym-substrat kompleks satt sammen for å utføre en bestemt nyttig funksjon. Denne forsamlingen er per definisjon en molekylær maskin, da det inneholder en ^12. Likevel, dets integrasjon med konstruerte delen - dirigerer re-den til en ny oppgave merking DNA-skader ¹² - fluorescerende dual hårnål.

Våre konstruere samler ut av en 32-mer DNA og enzymet vaccinia topoisomerase I (Vacc topo). Maskinen bruker deretter sitt eget materiale for å dikte to fluorescensmerkede detektor enheter (figur 1). En av enhetene (grønn fluorescens) bærer Vacc Topo kovalent festet til sin 3'end og en annen enhet (rød fluorescens) er et gratis hårnål med en terminal 3'OH. Enhetene er kortvarige og raskt montere tilbake til den opprinnelige konstruere, som senere recleaves.I fravær av DNA bryter disse to enhetene fortløpende separate og religate i en syklisk måte. I vev seksjoner med DNA-skade, topoisomerase-bærer detektor enhet selektivt festes til stump-ended DNA bryter med 5'OH (DNase II-type pauser) ^11,12, fluorescensmerket merking dem. Den andre, enzym-free hårnål dannet etter oligonukleotid cleavage, vil ligate til en 5'PO ₄ stump-ended pause (DNase I-typen pauser) ^11,12, hvis T4 DNA ligase er til stede i løsningen ^13,14. Når T4 DNA ligase er lagt til en vev avsnitt eller en løsning som inneholder DNA med 5'PO ₄ sløv-ended pauser, reagerer ligase med 5'PO _fire DNA ender, forming semi-stabile enzym-DNA komplekser. Den butte endte hårnåler vil samhandle med disse kompleksene frigjøre ligase og kovalent linking hårnåler til DNA, og dermed merking 5'PO ₄ stump-endte DNA pauser.

Denne utviklingen eksemplifiserer en ny praktisk tilnærming til the utforming av molekylære maskiner og gir en nyttig sensor for deteksjon av apoptose, og DNA-skader i faste celler og vev.

Protocol

Delene for molekylær maskin-basert gjenkjenning bør være forberedt første fordi deres forberedelser tar mer tid enn montering av molekylære enheten. Den konstruerer fungerer godt med 5-6μm tykke seksjoner kuttet fra Paraformaldehyde-fast, parafin-embedded tissue blokker. Bruk skyv merker som beholder deler godt, slik som ProbeOn Plus ladet og precleaned lysbilder (Fisher Scientific) eller lignende. Vi anbefaler å først bruke en vev med et velkjent mønster av DNA-skade som inneholder både DNase I-og DNase II-type bryter, som deksametason behandlet apoptotiske rotte thymus ^13,14.

1. Utarbeidelse av seksjoner

1. Plasser seksjoner i et lysbilde rack og dewax i xylen i 15 min, overføring til en ny xylen bad i ytterligere 5 minutter.
2. Rehydrere ved å passere gjennom gradert etanol konsentrasjoner: 96% Etanol-2x5min, 80% etanol - 5min; vann - 2x5 min.
3. Digest seksjon med Proteinase K. Bruk 100μL av en 50μg/mL løsning per seksjon. Inkuber 15 'ved romtemperatur (23 ° C) i en fuktet kammer. Tiden kan trenge justering avhengig av vevstype. Hard vev kan kreve lengre fordøyelsen. Ganger på 15-25 min er vanligvis brukt. Utilstrekkelig fordøyelsen kan resultere i svakere signal. Overdigestion på den annen side fører signal forsvinning og § avbrudd.
4. Skyll i destillert vann for 2x10 min.
5. Påfør 100 mL per seksjon på 2% BSA for preblocking. Inkuber i 15 min ved romtemperatur (23 ° C). I løpet av denne tiden montere den molekylære maskinen.

2. Molekylære maskiner montering

Alle reagenser er skalert for 25 mL totale volumet, noe som er tilstrekkelig for en enkelt påvisning i en gjennomsnittlig størrelse vev seksjonen (10x10mm). Volumet kan skaleres opp etter behov.

1. Kombiner i et lite plastrør i denne rekkefølgen:

<tr>

Bidistilled vann; 15% polyetylenglykol-8000; Løsning av 66 mM Tris-HCl, 7,5 pH, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, (dvs. vanlig T4 DNA ligase buffer); 70 pmoles av oligonukleotid 1, 215 pmoles (1,76 til 7,1 mikrogram) Vacc topo 10 enheter T4 DNA ligase (500 U / ml)

2. Bland forsiktig med pipettering. Den molekylære konstruere nesten umiddelbart selv setter sammen i denne løsningen, og kan brukes umiddelbart ved romtemperatur (23 ° C). Øke temperaturen til 37 ° C blokkerer T4 DNA ligase-baserte delen av merking.

3. Ved hjelp av molekylære maskiner i vev seksjoner dual label 5'OH og 5'PO4 DNA pauser

1. Aspirer preblocking løsningen og anvende 25μL av den fullstendige reaksjonen blandingen inneholder 70 pmoles av oligonukleotid 1, 53-215 pmoles (1,76 til 7,1 mikrogram) VaccTopo og 10 enheter T4 DNA ligase (500 U / ml) i løsning av 66 mM Tris-HCl, 7,5 pH, 5mm MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, og 15% polyetylenglykol-8000. Den samme sekvens oligonukleotid bærer en enkelt FITC etikett, oligonukleotid 2, kan brukes i stedet for deteksjon av en enkelt type DNA pauser. I slike tilfeller utelate ligase fra merking reaksjon. Også i denne situasjonen en løsning på 50mm Tris-HCL, 7,4 pH, 15% PEG-8000 kan brukes i stedet for T4 DNA ligase buffer.
2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur (23 ° C) i en fuktet kammer med en plast dekkglass. Beskytt mot lys. Senking av temperaturen til 16 ° C reduserer ligase-baserte signal; temperaturen øke til 37 ° C helt eliminerer ligase-baserte signal. En delvis hemming av ligase skjer noen ganger i reaksjonen mix, muligens på grunn av forurensninger innført med topoisomerase forberedelser. Derfor kan lengre inkubasjonstid (2-4 timer) være nødvendig, spesielt når det erignificant antall ligase-merket pauser er til stede. Selv om både ligase og topo signaler kan observeres på dette stadiet, i mange tilfeller ligase signalet kan bli ytterligere forbedret ved re-anvendelse av reaksjonen mix uten Vacc Topo og dual-merket oligonukleotid, men inneholder en hårnål formet oligonukleotid (oligonukleotid 3) (35 mg / ml) og T4 DNA ligase (250 U / ml). For å forbedre signal videre til trinn 3 for å se reaksjonen uten ekstrautstyr gå til trinn 5..
3. Fjern Dekkglass ved å forsiktig fordype lysbildene vertikalt i en Coplin krukke med vann ved romtemperatur. Aspirer overflødig vann.
4. Forbedre ligase signal ved å bruke 25 mL av reaksjonsblandingen uten Vacc Topo og oligonukleotid 1, men inneholder oligonukleotid 3: 66 mm-Tris HCl, 7,5 pH, 5 mM MgCl _2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, og 15% polyetylenglykol- 8000, 5 enheter T4 DNA ligase, 35 mg / ml oligonukleotid 3 (sløv endte hårnål). Det totale volumet av merking løsningen can bli skalert opp for å imøtekomme større seksjoner. Inkuber i 18 timer (over natten) ved romtemperatur (23 ° C) i en fuktet kammer med en plast dekkglass.
5. Fjern Dekkglass ved å forsiktig fordype lysbildene vertikalt i Coplin krukke med vann ved romtemperatur. Deretter vaskes seksjon 3x10 min i destillert vann.
6. Skyll med natriumbikarbonat buffer. Alkalisk løsning skyll forbedrer FITC fluorescens, som er pH sensitive og er betydelig redusert under pH 7.
7. Dekk seksjon med en antifading løsning (Vectashield med DAPI), dekkglass og analysere signalet med en fluorescerende mikroskop. Dobbel-strand DNA bryter med 5'OH vil fluoresce grønn, 5'PO ₄ bryter - vil fluoresce rød (figur 2).

Fire. Representant Resultater

Figur 1. Semi-kunstig molekylær machine registrerer to typerDNA skade in situ. Den fluorescerende maskin selv monterer når Vacc Topo bindes til den doble hårnål 32-mer. Maskinen starter driften ved å splitte seg opp i to detektor enheter via topoisomerase-laget kutt på 3 'enden av gjenkjennelse sekvens. Dette resulterer i en syklisk prosess der FITC-merket enhet kontinuerlig separerer og religates tilbake til rhodamine-merket enhet. Dette vedvarer inntil en påviselig DNA bruddet er oppstått. Når slike alternativ akseptor (5'OH butte enden DNA pause) er til stede i vevet delen, vil den FITC del ligate til det. De resterende rhodamine del vil legge til 5 'PO ₄ DNA butte enden bryter med hjelp av T4 DNA ligase. Følgelig er begge typer DNA brytes samtidig oppdaget.

Figur 2. Molecular maskin dual etiketter to typer DNA pauseri en vev del av deksametason behandlet thymus. Blunt-ended DNA bryter av DNase I-og DNase II-type er oppdaget i thymic kortikale områder gjennomgår apoptose. Grønn cytoplasmatisk fluorescens (5'OH DNA pauser) markerer cortical makrofager fordøye kjernefysisk materiale av apoptotiske thymocytter. Dette signalet er produsert av Vacc Topo, og lokaliserer til phagolysosomes med DNA inneholder 5'OH dobbel tråd pauser ^11,12. Rød fluorescens (5'PO _fire pauser) etiketter atomkjerner av apoptotiske thymocytter ikke oppslukt av makrofager. Massive mengder thymocytter samtidig gjennomgår apoptose ledsaget av generasjon 5'PO _fire dobbel-tråd pauser, visualiseres ved ligase-basert merking. Disse pausene er plassert ved kjernefysiske periferien, danner ring-formet mønster. Alle cellular kjerner er visualisert ved kontrafarging med DAPI (blå fluorescens).

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan å sette sammen og bruke en dual-merking DNA skade sensor. Sensoren er en molekylær maskin drevet av bio-molekylær-motoren, en virus-kodet protein Vacc Topo forbundet med kunstige komponenter. Den presenterte utviklingen eksemplifiserer en bio-aktivert tilnærming som talsmenn tilpasse biologiske strukturer, arkitekturer og faktiske deler og komponenter av celler til utforming av ikke-giftig molekylær skala enheter ^12,15. Denne tilnærmingen løser to problemer som ligger til feltet av in vivo nanosensorer: 1. vanskeligheten med å lage virkelig uniform og reproduserbare nano-konstruksjoner ved hjelp av tradisjonell nanomaterialer, og 2. den potensielle toksisitet, og høy biologisk reaktivitet av nanoprobes, partikler og andre svært spredt nanomaterialer. Sensoren integrerer en naturlig forekommende molekylær maskin med kunstig komponenter som re-direkte til en ny funksjon av DNA skade merking. Produktet av en slik integrasjon er en SEmi-kunstig molekylær maskin rettet mot en ny oppgave. Mens topoisomerases, polymeraser og andre enzymatiske maskiner er hyppig brukt i biokjemisk forskning, de er ikke integrert med konstruerte komponenter i individuelle molekylære forsamlinger. Følgelig i rutinemessig bruk, er de ikke ansatt som semi-kunstig enheter ^12.

Her viser vi hvordan du bruker sensoren i vevet delen format for samtidig merking av DNase I-og DNase II-type bryter. I dag er det ingen andre metoder tilgjengelig for å utføre slike samtidig dual deteksjon.

DNase I-og DNase II-type pauser er viktige markører av celledød progresjon, spesielt merking av apoptotiske self-autonome og phagocytic faser ^11,16. Sensoren er et nyttig tillegg til biomedisinsk forskning arsenal håndtere påvisning og detaljert karakterisering av apoptose.