Summary
والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.
Abstract
هذا البروتوكول يصف مضان المجهر القائم على فحص الشتلات Arabidopsis ويصف كيفية تعيين الطفرات المتنحية التي تغير توزيع التحت خلوية من علامة محددة فلوري المفتاحية في مسار إفرازية. Arabidopsis هو نموذج قوي البيولوجية للدراسات الجينية بسبب حجم الجينوم، الوقت جيل، والمحافظة على الآليات الجزيئية بين الممالك. الصفيف التنميط الجيني كنهج لرسم خريطة للطفرة في بديل للطريقة التقليدية القائمة على المؤشرات الجزيئية هو مفيد لأنه هو أسرع نسبيا، ويمكن السماح لرسم الخرائط من المسوخ عدة في فترة زمنية قصيرة حقا. وتسمح هذه الطريقة في تحديد البروتينات التي يمكن أن تؤثر على سلامة أي عضية في النباتات. هنا، على سبيل المثال، فإننا نقترح على شاشة لخريطة الجينات مهمة لسلامة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا). نهجنا، ومع ذلك، يمكن أن تمتد بسهولة إلى غيرها من عضيات الخلية النباتية(انظر على سبيل المثال 1،2)، وهكذا يمثل خطوة هامة نحو فهم الأسس الجزيئية التي تنظم الهياكل التحت خلوية أخرى.
Protocol
1. EMS المعالجة
وmutagenized بذور thaliana Arabidopsis باستخدام وكيل المغير سلفونات الميثان الإيثيلي (EMS) 3،4، والتي يدفع إلى التغييرات C-إلى-T الجينوم مما أدى إلى G / C إلى T / A الطفرات 5-7.
- وزن البذور ز 0،8 Arabidopsis (~ 40000 البذور) التي تحمل علامة فلوري عضية (على وجه التحديد، في هذه الدراسة ssGFPHDEL (إشارة تسلسل GFP-HDEL رباعي البيبتيد) وقد استخدم بوصفه علامة ER).
- نقل البذور في انبوب فالكون 50 مل، ثم يضاف 25 مل من الماء المقطر.
- إضافة 0.2٪ (V / V) إيثيل سلفونات الميثان.
- احتضان لمدة 16 ساعة على nutating الخلاط على سرعة منخفضة.
- نضح السائل وتجاهل ذلك في قارورة تحتوي على 1.0 متر هيدروكسيد الصوديوم إلى تعطيل النظام النقدي الأوروبي.
- إضافة 25 مل من الماء إلى أنبوب الصقر الذي يحتوي على البذور، وثيقة، وعكس 5 مرات لغسل البذور؛ الانتظار حتى كل بذور استقروا، ثم نضح الماء والتخلص من الصوديوم في 1،0 متر OH قارورة.
- كرر الخطوة غسل تصل إلى 10 مرات.
- بعد غسل النهائي، اعادة تعليق البذور في حد أدنى من المياه.
- الشروع في تعقيم البذور إضافة 25 مل من المبيض بنسبة 10٪، هزة بقوة لمدة 30 ثانية. اسمحوا بذور تسوية إلى أسفل، ثم صب قبالة التبييض وشطف مع 25 مل من الماء المعقم. تخلصي من الماء المعقم وإضافة 25 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. هزة الأنابيب لمدة 30 ق. اسمحوا بذور تسوية إلى أسفل. صب قبالة الإيثانول وشطف مع 25 مل من الماء المعقم. كرر مرتين يغسل مع الماء المعقم، ثم صب البذور على طبق بيتري من البلاستيك تحتوي على 3 ورقة مرشح MM واسمحوا الجافة تحت غطاء محرك السيارة. متجر في 4 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
- لوحة بذور في phytagel MS ½ (تركيز نصف متوسط Murashige وسكوغ)، و 150 ملم طبق بيتري (~ 250-300 البذور لوحة).
- تنمو بذور M1 على لوحة ل 2 أسابيع، ثم زرع في التربة.
- جمع البذور من النباتات M1 M2 الفردية لإنشاء خطوط M2 (1000 خطوط مستقلة).
في هذا القسم ونحن تصف مراقبة الشتلات مع المجهر متحد البؤر مضان أو كما هو موضح سابقا 8.
- وتزرع بذور الستين من كل سطر M2 لمدة 7 إلى 10 أيام في أطباق بتري بلاستيكية، ½ MS phytagel، بل على لوحة نفس تزرع أيضا 5 شتلات EMS-غير المعالجة (السيطرة).
- هي التي شنت خمس إلى عشر النبتات مع الجانب مجافي المحور باتجاه العدسة (40X) على شريحة المجهر ومرفقا به ساترة.
- ويلاحظ كل فلقة، من القشرية للمنطقة وسطي، في ظل تألق لتوزيع أي التحت خلوية المتغير للعلامة عضية.
- تزرع النباتات إيجابي في التربة ويتم جمع البذور وفحص مرة أخرى لتأكيد النمط الظاهري متحولة في الجيل M3.
- إزالة تلوث الطفرات الخلفية من خلال backcrossing ثلاث مرات على الأقل لجينوم البرية من نوع شارك ربماntaining علامة عضية المطلوب فلوري.
- من النبات الأم، وذلك باستخدام مقص غرامة أو ملقط إزالة siliques الناضجة، والزهور ومفتوحة.
- إزالة البراعم التي هي صغيرة جدا من النسيج الإنشائي.
- إدراج غيض من زوج واحد من ملقط بين بتلات وكأسية لفتح واحد برعم زهرة، وإزالة جميع anthers.
- باستخدام زوج واحد من ملقط تأخذ زهرة مفتوحة ناضجة من المصنع والد وفرك anthers على وصمة العار من النبات العاجزة.
3. رسم الخرائط
يصف هذا القسم كيفية أساسا لتعيين الطفرات المتنحية باستخدام بروتوكول تعديل Borevitz من (9) الذي هو أسرع إذا ما قورنت طرق رسم الخرائط التقليدية 10،11. هذا النهج استخدام صفائف قليل النوكليوتيد عالية الكثافة، مع القدرة على كشف العديد من الأشكال المتعددة للميزة واحدة (برامج التغذية التكميلية) في تجربة واحدة 12. باستخدام GeneChip Affymetrix ATH1 مجموعة Arabidopsis من الممكنتحليل ما يقرب من 24000 الجينات. تتم مقارنة بركة من الأفراد 2 F تظهر الطفرة إلى مجموعة من النباتات البرية من نوع 2 F جمعت بين السكان عزل نفسه. ثم، سيتم تعيين الطفرة في المنطقة، حيث يتم تخصيب تجمع متحولة عن الأليلات الوراثي متحولة، وبالتالي في المنطقة نفسها تجمع من النوع البري سيؤدي إلى إثراء لالأليلات الأصل البرية من نوع 13.
- ويتم استخراج الحمض النووي الجيني (3 ميكروغرام) من كولومبيا متحولة متماثلة اللواقح (M3) استخدام نبات DNeasy QIAGEN البسيطة عدة ويقدم للمحلل البورشيد الثاني الجينوم (GA الثاني) 14 التسلسل.
- وعبرت متماثل متحولة كولومبيا (M3) مع عمودي لاندسبيرغ لتوليد سكان رسم الخرائط.
- يتم تنفيذ التعيين على الأفراد ما يصل الى 100 70 F2 يظهر النمط الظاهري الشاذة ونفس العدد من النباتات F2 مع النمط الظاهري من النوع البري.
- جمع من كل ورقة نبات قرص (0.60 ملم) باستخدام لكمة ثقب. ووينبغي جمع القرص ورقة من أوراق من نفس الفئة العمرية للتأكد من الحصول على كميات مماثلة من الحمض النووي. يمكن معالجتها لاستخراج العينات الجينية على حدة أو في مجموعات. في هذه الحالة، فمن الممكن لجمع عينات من 5-10 لكل أنبوب إيبندورف بحيث في النهاية سيكون لديك عدد أقل من أنابيب إيبندورف من الحمض النووي الجيني الذي لابد من استخراجها.
- ويستخدم الحمض النووي ورقة النبات MasterPure كيت تنقية (Epicentre) لاستخراج الحمض النووي الجيني. وكميا في الحمض النووي الجيني تم الحصول عليها من كل عينة مع nanodrop.
- نفس الكمية من الحمض النووي الجيني من كل عينة ثم يتم وضع معا ما يصل الى ما مجموعه 300 نانوغرام (~ 30 ميكرولتر) من السلطات الوطنية المعينة النبات؛ إضافة 60 ميكرولتر 2.5x و حل البادئات العشوائية [125 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)، 12.5 ملم MgCl2، 25 مم 2-المركابتويثانول و 750 ميكروغرام / الاشعال oligodeoxyribonucleotide مل (octamers عشوائي)] (Bioprime عدة) و 42 ميكرولتر ماء (نهائي حجم 132 ميكرولتر).
- السلطات الوطنية المعينة في تفسد> 95 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقيقة.
- بارد على الجليد.
- إلى كل denatuأحمر الحمض النووي اضافة 15 ميكرولتر مزيج dNTPs 10X مع dCTP بيوتين [1 ملم البيوتين-14-dCTP، 1 ملم dCTP، 2 مم dATP، 2 مم dGTP، 2 مم dTTP في تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 1 ملم Na2EDTA] (Bioprime عدة)، وأكمل مع 3 بوليميريز Klenow ميكرولتر (عدة Bioprime).
- احتضان بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، اضافة 15 ميكرولتر 3 M NaOAc و 400 ميكرولتر الباردة EtOH 100٪؛ المزيج.
- في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم تدور في 20500 XG لمدة 15 دقيقة، وإزالة طاف، وتغسل مع 500 EtOH الباردة ميكرولتر 75٪.
- تدور في 20500 XG لمدة 10 دقيقة.
- الكريات DNA الجافة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وresuspend المياه في 100 ميكروليتر.
- استخدم 5 ميكرولتر للتحقق من المحصول وجودة في جل (الشكل 2).
- إرسال 95 ميكرولتر من رد فعل وصفها لArabidopsis GeneChip البرية من نوع ومتحولة لATH1 التهجين صفيف الجينوم.
- يتم فحص صفائف ويتم تحليل الملفات. CEL تم الحصول عليها باستخدام برنامج R ( http://www.r-project.oRG /).
- R تثبيت البرنامج، ثم فتح البرنامج ولصق السلسلة التالية:
مصدر (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
ثم اضغط على مفتاح العودة، هذا وسوف تثبيت الحزم Bioconductor القياسية ( http://www.bioconductor.org ). - في مجلد جديد على سطح المكتب الخاص بك، وتحميل من الموقع التالي ( http://www.naturalvariation.org/methods ) الملفات:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
وينبغي أن يكون مفتوح للColLerCEL.zip الملف والملفات الناتجة لصقها في مجلد جديد. - إعادة تسمية البيانات التي تم الحصول عليها من تجربة GeneChip الخاص بك إلى wildtype.CEL وmutant.CEL.
- الآن نسخ البيانات GeneChip الخاص بك (وwildtype.CELmutant.CEL) في مجلد.
- مفتوحة R، أ) لنظام التشغيل Mac: انقر على "متفرقات"، ثم انقر فوق "تغيير الدليل العمل". ب) لجهاز الكمبيوتر: انقر على "ملف" "دليل التغيير" ثم
- أ) لنظام التشغيل Mac: حدد المجلد الذي يحتوي على الملفات. انقر على زر "مساحة عمل"، "تحميل ملف مساحة العمل"، وath1V5.RData حدد ب) للكمبيوتر: اختر المجلد الذي يحتوي على ملفات أعلاه، انقر على زر "ملف"، ثم "مساحة عمل تحميل" وحدد ath1V5.RData.
- readCEL.R المفتوحة باستخدام المفكرة ونسخ النص كله إلى ر.
- SFP.R المفتوحة باستخدام المفكرة ونسخ النص كله إلى ر.
- Map.R المفتوحة باستخدام المفكرة ونسخ النص كله إلى ر.
- في إطار وحدة التحكم سترى الرسالة التالية:
X كروموسوم يحد ميغابايت YZ
جينات بحث في الطير لصق في هذا الرابط
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv؟action=download&chr=x&start=yونهاية = Z - نسخ ولصق الارتباط في متصفح الانترنت الخاص بك. وسوف تظهر نافذة ونسأل لفتح أو حفظ الملف، يجب عليك تحديد حفظ. اختيار اسم الملف وإرفاق ملحق ". XLS"، ثم انقر فوق حفظ.
- فتح الملف ". XLS"، حيث يمكنك العثور على تنسيق المشترك لمتحولة الخاص بك (ويمثل بيانيا النتيجة في الشكل 3).
- ضمن المنطقة المعينة في البورشيد تجميعها يقرأ من الجينوم متحولة تحديد معين التحولات EMS 4 من بين الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة. تكمل النمط الظاهري متحولة من قبل التحول مع مورثة نوع البرية (ق) باستخدام إجراءات المعيار 15.
4. ممثل النتائج
ويظهر الشكل 1 النهج المتبع لتحديد متحولة من المسار إفرازي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يبين الشكل 2 إعداد نموذجي من الحمض النووي الجيني المسمى والتهجين لمجموعة. في الشكل (3)، نتيجة لذلك يتوقع نموذجي بعد تحليل وتقديم البيانات التي تم الحصول عليها من الصفيف Arabidopsis GeneChip الجينوم ATH1.
تم الانتهاء من زراعة الشكل 1. النباتات المعدلة وراثيا Arabidopsis معربا عن ssGFPHDEL (ER علامة) (1) لانتاج البذور بما فيه الكفاية لمعالجة EMS (2). ثم زرعت البذور المعالجة مع نظم الإدارة البيئية لتوليد محطات M1 (3). كل مصنع M1 يمثل خط مختلفة وجمعت البذور بشكل منفصل عن كل واحد منهم. ومطلي البذور M2 على الركيزة MS ½ (4) وفرزهم ثم لعيوب في التشكل ER بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (5). خلال الفحص وجدنا أن الحفاظ على النباتات مورفولوجيا ER البرية من نوع (6) والنباتات التي تظهر معيبة الظواهر ER (7). وقد نمت هذه النباتات للحصول على جيل M3 والتأكيد على النمط الظاهري (8). تم استخدام الحمض النووي الجيني من مصنع M3 لSolexa البورشيد التسلسل (أ). نفس النباتوتستخدم أيضا لالصلبان مع لير، وزن للحصول على سكان رسم الخرائط F2 (ب).
تم تحميل الشكل 2. Bioprime ردود الفعل العشوائية وضع العلامات (5 ميكرولتر من 100 ميكرولتر) على٪ 1 الاغاروز هلام. لين (أ) هو من بين مجموعة من النباتات البرية من نوع F2، والصف B هي من بين مجموعة من النباتات F2 متحولة. (ماركر هو 1 كيلو بايت DNA-N3232 سلم، من NEB).
3 الشكل، والرقم الذي يشكل مثالا لرسم الخرائط من الطفرة-0 العقيد باستخدام GeneChip Arabidopsis صفيف الجينوم ATH1 التهجين. يقع طفرة في هذا المثال على تخوم كروموسوم 1، بواسطة أشرطة عمودية. وقضبان أفقية تمثل عتبات للكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفها هنا لدينا متحد البؤر المجهري القائم على فحص لتحديد الطفرات endomembrane. ويمكن تمديد هذا النهج بسهولة إلى العضيات الأخرى في الخلية التي بعلامات محددة بروتين فلوري المتاحة. ويستند الشاشة على تحديد الطفرات التي تظهر توزيع الشاذة من علامة فلوري إما في العضية المستهدفة أو إلى العضيات التي لا يفترض أن تحتوي على علامة. على التوالي، وهذه المسوخ التي تمثل السكان في فيؤدى قدرة عضية إلى subcompartimentalize علامة أو المسوخ التي لا يمكن نقل من مكان لآخر بشكل صحيح علامة بين العضيات. خلال الفحص لاحظنا أن بعض المسوخ أظهرت النمط الظاهري في مراحل التنمية المبكرة في أقرب وقت 7 أيام بعد الإنبات، ومع ذلك، والبعض الآخر أظهرت النمط الظاهري فقط في مرحلة لاحقة من التطور. بينما يمكن ربط هذا إلى عدد من الأسباب، بما في ذلك التنمية التي تعتمد على التعبير من تحورأليل (ق)، وهذا يشير إلى أنه ينبغي دراسة النباتات في مراحل النمو المختلفة (لا يقل عن 7 إلى 14 يوما) لضمان أن لا يتم التخلص من المسوخ لافتة بشكل محتمل.
النهج المبينة في هذا البروتوكول يسمح لنا لرسم خريطة الجينات في وقت قصير نسبيا بالمقارنة مع طريقة التعيين الكلاسيكية. في الواقع، وجمع عدد كاف من الأفراد للسكان F2 المستخدمة في صفيف GeneChip يتطلب وقتا كمية صغيرة نسبيا بالمقارنة مع محطات F2 اللازمة لإجراء غرامة رسم الخرائط الكلاسيكية. ومع ذلك، فإن هناك خطوات الهامة التي ينبغي مراعاتها. ينبغي أن يتم اختيار عينات من سكان F2 يظهر أو لا يظهر النمط الظاهري بعناية، منذ إضافة عدد ولو قليل من النباتات ذات النمط الظاهري عن طريق الخطأ في إدخال أخطاء في النتيجة النهائية. ويرتبط هذا في الغالب إلى حقيقة أن السكان F2 يستخدم لرسم الخرائط الخام هو صغير جدا. لهذا السبب، واختيار النباتات التي تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقاليةتبين لها أو لا تظهر وينبغي إجراء النمط الظاهري في كل مرة في نفس اليوم بعد الإنبات. هذا لأنه، كما ذكرنا أعلاه، قد تكون مرتبطة ظهور النمط الظاهري للنمو. نقطة أخرى مهمة للنظر هو أن ننظر بعناية في postalignment توليد البيانات المقبل، والتي يتم إنشاؤها بواسطة البرامج التي تقدم لنا معلومات هامة مثل نسبة يقرأ تحتوي على المتغير. القيمة النظرية المتوقعة للمتغير متخالف حوالي 50٪، وهذا يعني أن 50٪ من تسلسل سيتضمن المتغير في حين لمتغير متماثل، هو حوالي 100٪. للأسف لا يمكن للوضع بعد postalignment يكون بعيدا عن القيمة النظرية، في الواقع نسبة يقرأ تحتوي على المتغير لمتخالف يمكن أن تختلف من 20-80٪ بينما 60 حتي 100٪ لمدة 16 متماثل. ولذلك، لكي لا يغيب عن المفتاح النوكليوتيدات المفردة (SNP)، فمن المهم عدم تجاهل المسوخ مع نسبة أقل من 100٪ من إعادةإعلانات عن البديل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الكيميائية، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة، مكتب العلوم الأساسية للطاقة، ومكتب للعلوم، وزارة الطاقة الأميركية (عدد جائزة DE-FG02-91ER20021) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0948584) (اف ب). نحن شاكرون لكارين بيرد السيدة لتحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K.
- Maple, J., Moller, S. G.
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
