Summary
Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.
Abstract
Este protocolo descreve um rastreio microscópio de fluorescência baseada de plântulas de Arabidopsis e descreve como mapear mutações recessivas que alteram a distribuição subcelular de um marcador específico marcado fluorescente na via secretora. Arabidopsis é um poderoso modelo biológico para estudos genéticos devido ao seu tamanho de genoma, tempo de geração e conservação de mecanismos moleculares entre os reinos. A matriz de genotipagem como uma abordagem para mapear a mutação em alternativa ao método tradicional baseado em marcadores moleculares é vantajosa porque é relativamente rápido e pode permitir que o mapeamento de vários mutantes de um período de tempo muito curto. Este método permite a identificação de proteínas que podem influenciar a integridade de qualquer organela em plantas. Aqui, como um exemplo, é proposto um ecrã para mapear genes importantes para a integridade do retículo endoplasmático (RE). Nossa abordagem, no entanto, pode ser facilmente estendido para outras organelas celulares vegetais(Por exemplo, ver 1,2), e, portanto, representa um passo importante para compreender a base molecular que regula outras estruturas subcelulares.
Protocol
1. EMS Tratamento
Sementes de Arabidopsis thaliana são mutagenizado utilizando como agente mutagénico sulfonato de metano agente de etilo (EMS) 3,4, o que induz nos C-para-T genoma alterações resultantes em C / G para T / A mutações 5-7.
- Pesar 0,8 g de sementes de Arabidopsis (~ de 40.000 sementes) que transportam a organela marcador fluorescente (especificamente, neste estudo ssGFPHDEL (sequência sinal-GFP-HDEL tetrapéptido) tem sido utilizado como um marcador de ER).
- Transferir as sementes em um tubo Falcon de 50 ml, em seguida, adicionar 25 ml de água destilada.
- Adicionar 0,2% (v / v) etil-sulfonato de metano.
- Incubar durante 16 horas em nutação misturador a baixa velocidade.
- Aspirar o líquido e descartá-lo para um frasco contendo 1,0 M de NaOH para inactivar a EMS.
- Adicionar 25 ml de água para o tubo Falcon contendo as sementes, fechar e invertido 5 vezes para lavar as sementes; esperar até que todas as sementes se instalaram, em seguida, aspire a água e descarte-o a 1,0 M Na OH balão.
- Repetir o passo de lavagem até 10 vezes.
- Após a lavagem final, re-suspender as sementes numa quantidade mínima de água.
- Proceder à esterilização de sementes adicionando 25 mL de água sanitária a 10%, agitar vigorosamente por 30 s. Vamos resolver sementes para baixo, em seguida, deitar fora lixívia e lavar com 25 mL de água estéril. Decantar a água estéril e adicionar 25 mL de etanol a 70%. Agitar os tubos por 30 s. Vamos resolver sementes para baixo. Decantar o etanol e lavar com 25 mL de água estéril. Repetir duas vezes a lavagem com água esterilizada, em seguida, deitar sementes em uma placa de Petri de plástico contendo 3 MM de papel filtro e deixe secar sob o capô. Armazenar a 4 ° C durante 2 dias.
- Placa de as sementes em ½ MS phytagel (concentração metade do meio de Murashige e Skoog), 150-milímetros placa de Petri (aprox. 250-300 sementes para prato).
- Crescer sementes M1 na placa para 2 semanas, depois transplantar para o solo.
- Coletar sementes M2 de plantas individuais M1 para gerar linhas de M2 (1000 linhas independentes).
Nesta secção descreve-se a observação de plântulas com um microscópio confocal de fluorescência ou como descrito anteriormente 8.
- Sessenta sementes de cada linha M2 são cultivadas durante 7 a 10 dias, em pratos de plástico de Petri, ½ MS Phytagel; na mesma placa também são cultivadas 5 mudas EMS-não tratado (controlo).
- Cinco a 10 cotilédones são montados com o lado abaxial para a lente (40X) numa lâmina de microscópio e fechado com uma lamela.
- Cada cotilédone é observado, a partir do cortical para a região medial, sob fluorescência para qualquer distribuição alterada subcelular do marcador organela.
- Plantas positivas são transplantadas para o solo e as suas sementes são recolhidas e peneirada novamente para confirmar o fenótipo mutante na geração M3.
- Remover os contaminantes mutações de fundo através de retrocruzamento, pelo menos, três vezes para um genoma de tipo selvagem, possivelmente, containing o desejado marcador organela fluorescente.
- A partir da planta-mãe, usando tesouras ou pinças finas remover siliques maduros e flores abertas.
- Remova os botões que são demasiado pequenos do meristema.
- Insira a ponta de um par de fórceps entre pétalas e sépalas de abrir um botão de flor e remover todas as anteras.
- Usando um par de fórceps levar uma flor aberta maduro da planta pai e esfregar as anteras sobre o estigma da planta emasculado.
3. Mapeamento
Esta secção descreve essencialmente como mapear uma mutação recessiva usando um protocolo modificado de Borevitz 9, que é mais rápido se comparado com os métodos tradicionais de mapeamento 10,11. Esta abordagem utilizar matrizes de alta densidade de oligonucleótidos com a capacidade de detectar polimorfismos numerosas única característica (SFPs) num único ensaio 12. Usando o Arabidopsis Affymetrix matriz GeneChip ATH1 é possívelanalisar aproximadamente 24.000 genes. Um conjunto de indivíduos F 2 mostrando a mutação é comparado a um pool de tipo selvagem de plantas F 2 recolhidos dentro da mesma população de segregar. Em seguida, a mutação irão ser mapeado na região onde o pool mutante é enriquecido para alelos de genótipos mutantes e, consequentemente, na mesma região da piscina do tipo selvagem irá resultar enriquecida para os alelos de tipo selvagem-mãe 13.
- O ADN genómico (3 ug) é extraído do homozigótica mutante Columbia (M3), utilizando um Qiagen DNeasy Plant Kit Mini e é submetido à Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sequenciação.
- O mutante homozigótica Columbia (M3) é cruzada com Landsberg erecta para gerar uma população de mapeamento.
- O mapeamento é realizado em 70 até 100 indivíduos F2 mostrando o fenótipo aberrante e do mesmo número de plantas F2 com um fenótipo de tipo selvagem.
- Cobrar de cada planta um disco foliar (0,60 mm) com um perfurador de furo. Odisco de folha devem ser coletadas a partir de folhas da mesma idade para ter certeza de ter quantidades similares de DNA. As amostras podem ser processadas para a extracção genómico separadamente ou em grupos. Neste caso, é possível recolher amostras 5-10 para cada tubo de Eppendorf de modo que no final terá tubos eppendorf menos a partir do qual o ADN genómico tem de ser extraído.
- Planta MasterPure da folha de DNA Purificação Kit (Epicentre) é utilizado para extrair o ADN genómico. O DNA genómico obtido a partir de cada amostra é quantificada com um nanodrop.
- A mesma quantidade de ADN genómico a partir de cada amostra é então colocada em conjunto, até um total de 300 ng (~ uL 30) de DNAs de plantas; adicionar 60 uL 2.5X solução iniciadores aleatórios [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-mercaptoetanol, 750 ug / ml iniciadores oligodeoxyribonucleotide (octâmeros aleatórios)] (Bioprime kit) e 42 uL de água (volume final de 132 uL).
- DNAs desnaturar a> 95 ° C durante 5 a 10 min.
- Esfriar em gelo.
- Para cada denatuvermelho DNA adicionar 15 uL mistura dNTPs 10X com biotina dCTP [1 mM de biotina-14-dCTP, 1 mM de dCTP, 2 mM de dATP, 2 mM de dGTP, dTTP 2 mM em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de Na2EDTA] (Bioprime kit), e completar com 3 polimerase Klenow uL (kit Bioprime).
- Incubar durante a noite a 25 ° C.
- No dia seguinte, adicionar 15 uL 3 M NaOAc e 400 uL frio EtOH a 100% e misturar.
- Incubar a -80 ° C durante 1 hora, em seguida, girar à 20.500 xg durante 15 min, remover o sobrenadante, e lavou-se com 500 EtOH frio uL de 75%.
- Girar em 20.500 xg durante 10 min.
- Pelotas de matéria seca de ADN a 37 ° C durante 10 min e ressuspender em água a 100 uL.
- Use 5 uL de verificar o rendimento ea qualidade sobre um gel (Figura 2).
- Enviar 95 uL de etiquetagem de reacção para o Arabidopsis GeneChip de tipo selvagem e mutante para ATH1 Hibridação matriz Genoma.
- As matrizes são digitalizados e os arquivos. CEL obtidos são analisados utilizando o software R ( http://www.r-project.org /).
- Instale o software R, em seguida, abra o programa e cole o seguinte texto:
fonte (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Em seguida, pressione retorno chave esta irá instalar os pacotes padrão (BioConductor http://www.bioconductor.org ). - Em uma nova pasta no seu desktop, baixar no seguinte site ( http://www.naturalvariation.org/methods ) os arquivos:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
O ColLerCEL.zip arquivo deve ser descompactado e os arquivos resultantes colado em sua nova pasta. - Renomeie os dados obtidos a partir de sua experiência em GeneChip wildtype.CEL e mutant.CEL.
- Copie agora os seus dados de GeneChip (wildtype.CEL emutant.CEL) em sua pasta.
- Abrir R, a) para Mac: clique em "Outros", e clique em "Altere o diretório de trabalho." b) para PC: clique em "Arquivo" e depois "Altere o diretório"
- a) para Mac: Selecione a pasta que contém os arquivos. Clique em "Área de Trabalho", "arquivo de espaço de trabalho Load" e selecione ath1V5.RData, b) para PC: Selecione a pasta que contém os arquivos acima, clique em "Arquivo", depois "espaço de trabalho Load" e selecione ath1V5.RData.
- ReadCEL.R aberto usando o Notepad e copiar o texto todo para R.
- SFP.R aberto usando o Notepad e copiar o texto todo para R.
- Map.R aberto usando o Notepad e copiar o texto todo para R.
- Na janela do console, você verá a seguinte mensagem:
X cromossomo limita Mb yz
Pesquisar em genes TAIR colar neste link
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& Fim = z - Copie e cole o link em seu navegador de internet. Uma janela irá aparecer e pedir para abrir ou salvar o arquivo, você deve selecionar salvar. Escolha um nome de arquivo e anexar a extensão ". Xls", clique em Salvar.
- Abra o arquivo ". Xls", onde você pode encontrar a coordenada para o seu mutante (o resultado é representado graficamente na Figura 3).
- Dentro da área mapeada no Illumina montado lê do genoma mutante identificar transições específicas EMS 4 entre os polimorfismos de nucleotídeos únicos. Complementar o fenótipo mutante por transformação com o gene de tipo selvagem (s) usando procedimentos padrão 15.
4. Os resultados representativos
A Figura 1 mostra a abordagem utilizada para a identificação de um mutante do via secretora utilizando microscopia confocal de triagem. A Figura 2 mostra uma preparação típica de rotulado ADN genómico para hibridação matriz. Na figura 3, um resultado típico esperado após a análise dos dados obtidos a partir da matriz do Genoma GeneChip Arabidopsis ATH1 é apresentado.
Figura 1. Arabidopsis plantas transgénicas que expressam ssGFPHDEL (ER marcador) (1), foram cultivadas para produzir sementes suficientes para EMS tratamento (2). Sementes tratadas com EMS foram então semeadas para gerar plantas M1 (3). Cada planta M1 representa uma linha diferente e sementes foram recolhidos separadamente de cada um deles. Semente M2 foram plaqueadas em ½ substrato MS (4) e, em seguida, rastreados por defeitos na morfologia ER por microscopia confocal (5). Durante o rastreio encontramos plantas que conservada do tipo selvagem morfologia ER (6) e plantas que mostram defeituosos fenótipos ER (7). Estas plantas foram cultivadas para obter a geração M3 e para confirmar o fenótipo (8). DNA genómico de planta M3 foi utilizado para Solexa Illumina sequenciação (a). A mesma plantatambém foi utilizado para os cruzamentos com LER-em peso a obtenção de uma população de mapeamento F2 (b).
Figura 2. Bioprime reacções de rotulagem aleatórios (5 uL de 100 uL) foram carregadas em gel de agarose a 1%. Lane, um é de um pool de tipo selvagem plantas F2, e Lane b é a partir de um conjunto de mutantes plantas F2. (Marcador é 1 Kb de DNA escada-N3232, a partir de NEB).
Figura 3. A figura representa um exemplo de mapeamento de Col-0 mutação usando GeneChip Arabidopsis ATH1 Hibridação Matriz Genoma. A mutação neste exemplo está localizado no cromossoma 1 delimitado, por barras verticais. As barras horizontais representam os limiares para detecção.
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Discussion
Aqui, foi descrito um rastreio de microscopia confocal baseado na identificação de mutantes endomembrane. Esta abordagem pode ser facilmente adaptado para outras organelas da célula para os quais marcadores específicos de proteínas fluorescentes estão disponíveis. A tela é baseado na identificação de mutantes que mostram uma distribuição aberrante do marcador fluorescente, quer na organela alvo ou para organelas que não são supostos para conter o marcador. Respectivamente, estes mutantes representam populações em que quer a capacidade de a organela para subcompartimentalize o marcador é comprometida ou mutantes que não podem adequadamente translocar o marcador entre organelos. Durante a triagem notamos que alguns mutantes mostraram um fenótipo em estágios iniciais de desenvolvimento já em 7 dias após a germinação, no entanto, outros mostraram o fenótipo apenas em um estágio posterior de desenvolvimento. Embora isso possa ser ligado a um número de razões, incluindo a expressão desenvolvimento-dependente do mutantealelo (s), isto sugere que as plantas devem ser examinadas em diferentes estádios de desenvolvimento (pelo menos 7 a 14 dias) para garantir que os mutantes potencialmente interessantes não são descartados.
A abordagem descrita neste protocolo permite-nos para mapear um gene em um período de tempo relativamente curto em comparação com o método de mapeamento clássica. Na verdade, na recolha de um número suficiente de indivíduos da população F2 utilizado para a matriz GeneChip requer um tempo de quantidade relativamente pequena em comparação com plantas F2 necessários para o procedimento de mapeamento fino clássica. No entanto, há passos críticos que devem ser observados. Seleção de amostras da população F2 mostrar ou não mostrar o fenótipo deve ser realizada com cuidado, uma vez que a adição de até mesmo um pequeno número de plantas com o fenótipo errado por engano pode introduzir erros no resultado final. Isto é principalmente ligada ao facto de que a população F2 usado para o mapeamento bruto é muito pequena. Por esta razão, a selecção de plantas que eitela mostrar ou não mostrar o fenótipo deve ser realizada toda vez que no mesmo dia após a germinação. Isto é porque, como já mencionado acima, a aparência do fenótipo pode estar ligada ao crescimento. Outro ponto importante a considerar é o de olhar atentamente para o próximo postalignment de geração de dados, que é gerado por programas que nos dão informações importantes, como o percentual de lê contendo a variante. O valor teórico esperado para uma variante heterozigótica é de cerca de 50%, isto significa que 50% das sequências que contêm a variante enquanto que para uma variante homozigótica, é de cerca de 100%. Infelizmente, a situação depois de um postalignment pode ser medida a partir do valor teórico, de facto, a percentagem de lê contendo a variante para heterozigótica pode variar desde a 20% a 80 enquanto que a partir 60 a 100% para 16 homozigoto. Por conseguinte, a fim de não perder as principais polimorfismos de um único nucleótido (SNP), é importante que não se desfazer mutantes com menos de 100% percentagem de reanúncios para a variante.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio da Ciência Química, Geociências e Biociências Divisão, Escritório de ciências básicas da energia, Secretaria de Ciência, Departamento de Energia dos EUA (número prêmio DE-FG02-91ER20021) e National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Somos gratos à Sra. Karen Pássaro para a edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
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