Summary
Multiphoton microscopy af hele muse organer er mulig ved optisk fjerne organ før billeddannelse, men ikke alle protokoller bevare det fluorescerende signal af fluorescerende proteiner. Brug af et optisk clearing metode med ethanol-baseret dehydrering og benzylalkohol: benzylbenzoat clearing, viser vi i høj opløsning multiphoton billeder af hele musehjerne udtrykker YFP.
Abstract
Multiphoton microscopy af iboende fluorescens og anden harmoniske generation (SHG) af hele muse organer er gjort mulig ved optisk fjerne organ før billeddannelse. 1,2 For organer, der indeholder fluorescerende proteiner, såsom GFP og YFP, optiske clearing protokoller, der anvender methanol dehydrering og tydeligt ved hjælp af benzylalkohol: benzylbenzoat (Babb), mens ubeskyttet mod lys 3 ikke bevarer den fluorescerende signal. Protokollen præsenteres her er en hidtil ukendt måde at udføre helt organ optiske clearing på musehjerne samtidig fluorescenssignalet for YFP udtrykkes i neuroner. Ændring af den optiske clearing protokol, således at organet dehydratiseres under anvendelse af en ethanol gradueret række har vist sig at reducere beskadigelse af fluorescerende proteiner og bevare deres fluorescerende signal for multiphoton billeddannelse. 4. Brug en optimeret fremgangsmåde til optisk clearing med ethanol-baseret dehydrering og clearing af Babbmens afskærmet fra lys, viser vi høj opløsning multiphoton billeder af gult fluorescerende protein (YFP) ekspression i neuronerne i en musehjerne mere end 2 mm neden under vævsoverfladen.
Protocol
1. Animal Perfusion 5 og Whole Mouse Brain Clearing
- Hele længden af proceduren kan variere afhængigt af, hvor lang tid anvendt pr dehydratiseringstrin, men i alt hele processen kan udføres i to dage.
- Afvej YFP mus og derefter dybt bedøve med en intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg).
- Bekræft et kirurgisk plan af dyb anæstesi før man går videre til kirurgi. Kontroller dyret hver 5 min for at se om den reagerer på en fast tå eller hale knibe. Hvis dyret reagerer, er en supplerende dosis (1/3 af den oprindelige dosis) af ketamin / xylazin påkrævet.
- Når dybt bedøvet, begrænse musen ved at klæbe hvert ben til en kirurgisk seng med lab tape, så musen er i liggende stilling (dorsal recumbancy), udsætter sit bryst til operation. Den kirurgiske leje er sædvanligvis fremstillet af et metal eller plastic mesh og anbringes i en vask eller på toppen af en sammenbidt-pan, således at blod og fiksativaffald kan nemt blive indsamlet.
- Til at begynde, lave et snit under xyphoid proces. Skåret langs bunden af brystkassen med saks og pincet og trække den tilbage hud som snittet er foretaget. Gøre to snit langs hver side af muse brystbenet (gennem ribbenene) for at skabe en klap af væv, som holdes væk fra brysthulen under anvendelse af en hæmostat at forlade hjertet udsat.
- Indsæt en 23 g nål i den venstre ventrikel af hjertet og lave et lille snit i musklen væggen af det højre atrium for at tillade blod at undslippe. Der henvises til Jové artikel 2497 for en video af denne procedure. 5
- Umiddelbart efter højre atrium skæres, begynder en perfusion med 4 ° C phosphatbufret saltvand, PBS, (pH 7,2), indtil blodet ikke længere observeres dræning fra højre atrium af hjertet (30 til 40 ml med en hastighed på omkring 5 ml / min).
- Når alt blodet er blevet drænet (væske forlader højre forkammer er klar), skifte perfusionsmediet til en kølet 4%PFA opløsning. Perfundere indtil musens krop bliver mærkbart stiv og kold at røre ved (ca. 30 - 40 ml med en hastighed på omkring 5 ml / min). (Koncentreret 16% PFA opløsning fortyndes i henhold til producentens anvisninger og NaOH tilsættes, indtil pH 7,2 er nået. Brug handsker og laboratoriekittel og håndtere og blande kemikalier inde i en emhætte.)
- Efter perfusion, fjernes musen fra den kirurgiske seng og halshugge at påbegynde udskæring af hjernen.
- Brug en pincet og iris saks, kraniet fjernes i små sektioner startende fra bagsiden af kraniet og bevæger sig fremad. Lav små snit hver 2 - 4 mm med saksen i hele kraniet, mens du bruger tangen til forsigtigt at trække knoglen væk fra hjernen i små sektioner. Gøre dette, indtil hele overfladen af hjernen er udsat for.
- Udskære hjernen fra kraniet ved en 5 mm bred, flad spatel og anbringes i et hætteglas. Nedsænkes i 4% PFA i 6 timer ved 4 ° C for efter fiksering.
- Efter indlægfiksering, vaskes hjernen to gange i stuetemperatur PBS ved at hælde PFA ud af hætteglasset og erstatte den med PBS. Swirl hjernen i PBS-opløsning før hælde ud og erstatte med PBS til en anden vask.
- Dehydratisere hjernen ved stuetemperatur ved en gradueret række af ethanol inkubationer (én gang i 50%, 70%, 95%, og to gange i 100%) ved 2 timer pr inkubation, og derefter 12 timer for den anden 100% ethanol inkubering, at udtrække vand fra fikseret væv. For hver inkubation hældes i det foregående ethanolopløsning fra hætteglas af glas og erstatte det med den efterfølgende opløsning, indtil hjernen er helt neddykket.
- Efter den anden inkubering i 100% ethanol, udøse opløsningen og erstat med lige dele ethanol og clearing opløsning indeholdende benzylalkohol og benzylbenzoat (1:2 vol: vol-forhold). Efter 2 timers inkubation dekanteres denne opløsning og erstatte med en 100% opløsning af benzylalkohol og benzylbenzoat (1:2 vol: vol-forhold). The refractive indeks for clearing løsning er n = 1,54.
- Når du er i Babb, vil hjernen bliver mærkbart gennemsigtig, inden for 4 - 5 timer. For de bedste clearing resultater, forlader hjernen for at fjerne i 6 dage ved stuetemperatur, medens beskyttet mod stærkt lys.
2. Mikroskop Setup
- Når hjernen ryddes og klar til billeddannelse, anbringe den i bunden af en petriskål med cyanoacrylat. Lad limen tørre, før du fortsætter.
- Efter tørring, nedsænkes hjernen i Babb og placere petriskålen under mikroskopet mål for billeddannelse.
- Vi bruger en multiphoton mikroskop, der inkorporerer en Mai Tai titanium safir laser justerbar mellem en 710 nm til 990 nm excitationsbølgelængde. Excitationsbølgelængden vi bruger til at generere YFP-signaler er 886 nm. Laser effekt varierer fra 30 til 100 mW afhængig af imaging dybde.
- Fange det reflekterede fluorescerende signal under anvendelse af et Nikon 5X objektiv (NA, 0.5), der giver mulighed for storefield-of-view billeddannelse (2 x 2 mm).
- Filtrere det reflekterede fluorescerende signal under anvendelse af en 535/50 båndpasfilter og samle den med en Gaasp PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Proces billeder med ScanImage software 6 med en opløsning på 2048 x 2048 pixels ved hjælp af en scanning hastighed på 2 ms pr linje for at generere høj opløsning, YFP billeder.
- Når billeddannelse er færdig, skal du fjerne hjernen fra petriskålen med pincet og opbevar den i Babb afskærmet fra lys til fremtidig billeddannelse. For limede prøver, fjernes vævet ved at køre et barberblad mellem limen og petriskålen under en vinkel på højst 30 grader. Vi har gemt prøver i Babb i op til 1 år uden nogen synlig nedbrydning.
3. Repræsentative resultater
De repræsentative billeder og videoer vist her demonstrere høj opløsning multiphoton billeddannende evne muliggjort af optisk clearing. Hele hjernen billedbehandling giverfor YFP-mærkede neuroner i de forskellige lag af hippocampus og cortex er klart synlig så dybe som 2 mm under overfladen på vævet. Figur 1 viser et repræsentativt billede af en koronal billede svarende til de anatomiske træk af hippocampus ved 2,92 mm caudal til bregma 7. Dybden af billeddannelse i prøven var 1,94 mm. En del af denne forskel skyldes fjernelse af cerebellum ved den kaudale ende af hjernen og resten skyldtes krympning af dehydratiseringsprocessen. Et andet billede fra figuren viser laget V / VI pyramidale neuroner i neocortex udtrykker YFP 2 mm under overfladen på vævet (fig. 2). Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af Nikon 5X objektiv og forstørrelse blev gjort ved hjælp af digital zoom-funktionen til billedbehandling køb i ScanImage software.
Ved at zoome ind på neocortex, er de enkelte axoner og Neuron celle organer pyramideformede neuroner i lag V i neocortex klarly skelnes op til 1,02 mm under vævsoverfladen (figur 3). Brug af billedstak af figur 3, blev et 3D rekonstruktion af neuron-regionen fremstilles under anvendelse ImageJ software 8 (fig. 4).
Den høje opløsning evne MPM også giver os mulighed for at præsentere billeder af helhed, enkelte neuroner. Her viser vi en rekonstruktion af et lag V pyramideformet neuron af neocortex, hvor individuelle dendritiske processer er klart synlige (figur 5).
Figur 1 Repræsentant billede fra en 1,2 mm billedstak (0,8-2 mm under vævsoverfladen). Af hele musehjerne viser neocortex, og de forskellige lag af hippocampus. Funktioner af hippocampus er synlige 1,1 mm under overfladen på vævet og er blevet mærket under anvendelse af følgendelende kode:. DG = tandet gyrus, GrDG = granulære lag af GD, Lmol = lacunosum moleculare lag, Mol = molekylære lag DG, eller = Oriens lag, PoDG = polymorf lag DG, Py = pyramideformet cellelag, Rad = stratum radiatum 7 Billede er 1,8 x 1,8 mm i størrelse, skala bar = 200 um. Den rostrale ende af hjernen er blevet anbragt på en petriskål med den kaudale ende opad mod målet. Dette lettede billeddannelse i det koronale plan.
Figur 2 Repræsentant ramme fra 1,2 mm billedstak (0,8-2 mm under vævsoverfladen). Af hele musehjerne fremhæver neocortex. Pyramidale celler og processer, der udtrykker YFP i laget V / VI i cortex er synlige 2 mm under vævsoverfladen. Graden af mærkningen er i overensstemmelse med tidligere rapporter om den sparsomme mærkning i neocortex. 9 Nedfældning (til højre) er udvidet fra b oxed område på venstre. Billede er 1,8 x 1,8 mm i størrelse, skala bar = 200 um (50 um indsat).
Figur 3. Repræsentant frame taget 774 um under vævsoverfladen fra billedet stakken af lag V pyramidale neuroner i neocortex af hjernen. Stak går fra 700 um til 1.020 um beneath vævsoverfladen. En 8x digital zoom blev anvendt til at indfange detaljer såsom fine processer. Billedet er 225 x 225 um i størrelse, skala bar = 20 um.
Figur 4. Repræsentant billede af 3D rekonstruktion (225 x 225 x 320 um) af billedet stakken i figur 3. Billedet er 225 x 225 um i størrelse, skala bar = 28 um.
Figur 5. Høj opløsning rekonstruerede billede af et lag V pyramideformet neuron af neocortex med en 10x digital zoom. Neuron måler 485 um i længde, skala bar = 25 um. Synsfeltet for hvert billede flise er 180 um x 180 um. Hver flise er på en anden dybde (z-niveau). De cortikale apikale dendritter ikke i almindelighed express YFP samt soma. At have begge i samme synsfelt, som vist her, blev magt sænket for at minimere mætning af soma, hvilket gør den fine proces udseende lysdæmper. Vores fokus her var på at demonstrere field-of-view i stedet for fine detaljer. At afsløre finere detaljer, skal du bruge en digital zoom, fokusere på en region uden soma, og øge lasereffekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens standard organiske farvestoffer er kompatibel med en række af organiske opløsningsmidler, og derfor ikke udgør en særlig udfordring for clearing protokoller, fluorescerende proteiner er ofte mindre tolerante over for ændringer i opløsningsmiddel. 4 Målet med det foreliggende arbejde var at overvinde en alvorlig begrænsning af tidligere optiske clearing protokoller, hvor fluorescens af XFPs blev tabt eller alvorligt forringet. De billeder, der er præsenteret her, viser, at fluorescens fra YFP blev bevaret. Den optiske Skrabningsteknikken beskrevet her tillader høj opløsning billeddannelse af YFP-mærkede neuroner i hele musehjerne op til 2 mm under vævsoverfladen. Anvendelse af ethanol dehydrering, som påvist tidligere, vil også bevare grønne og røde fluorescerende protein signaler. Fire de viste billeder vise, hvordan denne optiske clearing teknik kan anvendes til at studere helt organ områder, såsom hippocampus og neocortex der udtrykker fluorescerende proteiner. Den højeOpløsning evne multiphoton microscopy tillader også klart forstørrelse på specifikke celler eller områder af interesse inden for organ-regionen. De vigtigste punkter for at bevare protein fluorescens er at undgå overdreven fiksering, at sørge for, at fiksativ og alle løsninger fastholdes på tæt på neutral pH, for at bruge ethanol i stedet for methanol for dehydrering, og at opbevare prøverne i mørke.
Selv om vi viser her brugen af optiske clearing til billeddannelse af musehjerne, at teknikken er generelt anvendelig til de fleste organer. I denne undersøgelse viste vi højopløselige billeder af hele musehjerne regioner (neocortex og hippocampus) og specifikke neuroner i lag V i neocortex (Den Thy1-YFPH mus line etiketter pyramideformede celler i hippocampus og tyndt i neocortex, 9 andre regioner er mørke.). Brug af billedstak af Layer V pyramidale neuroner, blev et 3D rekonstrueret volumen af neuroner oprettet. Den lethed med which disse billeder blev taget til fange dybt inde i musen hjernen ved høj opløsning efter optisk clearing gør dette til et effektivt værktøj til at studere neuroanatomi. Imidlertid blev mens grå materie rydder særdeles godt, imaging dybde i hjernen i sidste ende begrænset af ufuldstændig clearing af tætte hvide substans skrifter nær midten af hjernen. Dette er ikke et problem i andre organer.
En ulempe ved anvendelse af Babb for clearing er, at det ikke er kompatibelt med konventionelle dypning mål. Den høje brydningsindeks af opløsningsmidlet gør det muligt clearing resulterer i optiske aberrationer, og opløsningsmidlet kan opløse den lim, der holder linserne på plads i målet. Vi har derfor brugt en makro linse, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, der kombinerer en ~ 2-mm field-of-view med en lateral opløsning på ~ 400 nm (1 / e radius) og aksial opløsning på ~ 4,9 um (1 / e radius). Linsen har også en korrektion krave for at kompensere for sfæriske aberrationer. Men denne linsehar en 22 mm ryg blænde og derfor ikke kan nemt tilpasses til standard kommercielle systemer. Man kunne maskine en brugerdefineret tråd adapter for at aktivere montere linsen på en standard mikroskop, men der skal sørges for at sikre, at exciteringsstrålen profil fylder ryggen blænde så meget som muligt at udnytte den tilgængelige numeriske åbning. Mens denne linse var i stand til at fokusere gennem et relativt stort dybde (~ 2 mm) uden fordybelse i Babb opløsning, er dens 0,5 NA ikke giver tilstrækkelig opløsning til billeddannelse dendritiske spidser. En linse med en højere NA på mindst 0,6 og ~ 40X forstørrelse kan håndtere dendritiske spidser. Dog skal den have tilstrækkelig bearbejdning afstand for at undgå nedsænkning i Babb opløsning. Opretholdelse af denne afstand vil sandsynligvis begrænse dybden af z-stakken billede til et godt stykke under 2 mm dybde tilgængelig via clearing.
Det skal bemærkes, at fiksering og clearing kan øge signalet fra udgangenogenous kilder til fluorescens. Dette undgås bedst ved at vælge længere bølgelængde excitation (> 800 nm), og omhyggeligt valg af emissionsfiltre til godt svarer fluorescensspektret af indikatorfarvestoffet.
For nylig er en ny urinstof-base klaringsmiddel benævnt SCALE blevet påvist at opretholde signalet fra fluorescerende proteiner 10, men det tager 2 uger - 6 måneder for at fjerne en prøve, sammenlignet med et par timer til Babb. SCALE lader også vævet meget skrøbelig, med store mængder af væv ekspansion, og brugen af urea, som denaturerer mange proteiner, vil sandsynligvis være problematisk for opfølgende undersøgelser med immunhistokemi. I modsætning hertil har selv clearing proces kan resultere i nogle ensartet væv krympning (~ 20%), clearing med Babb vist sig at være kompatible med standard histologisk behandling 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forsøg på dyr blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat ved Yale University Institutional Animal Care & Use udvalg.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jacob Solis for hans assistance i videoredigering.
Dette arbejde blev finansieret delvist af en NSF KARRIERE Award DBI-0953902 til MJ Levene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
