Summary

Multiphoton Mikroskopi af Cleared Mouse Brain udtrykker YFP

Published: September 23, 2012
doi:

Summary

Multiphoton microscopy af hele muse organer er mulig ved optisk fjerne organ før billeddannelse, men ikke alle protokoller bevare det fluorescerende signal af fluorescerende proteiner. Brug af et optisk clearing metode med ethanol-baseret dehydrering og benzylalkohol: benzylbenzoat clearing, viser vi i høj opløsning multiphoton billeder af hele musehjerne udtrykker YFP.

Abstract

Multiphoton microscopy af iboende fluorescens og anden harmoniske generation (SHG) af hele muse organer er gjort mulig ved optisk fjerne organ før billeddannelse. 1,2 For organer, der indeholder fluorescerende proteiner, såsom GFP og YFP, optiske clearing protokoller, der anvender methanol dehydrering og tydeligt ved hjælp af benzylalkohol: benzylbenzoat (Babb), mens ubeskyttet mod lys 3 ikke bevarer den fluorescerende signal. Protokollen præsenteres her er en hidtil ukendt måde at udføre helt organ optiske clearing på musehjerne samtidig fluorescenssignalet for YFP udtrykkes i neuroner. Ændring af den optiske clearing protokol, således at organet dehydratiseres under anvendelse af en ethanol gradueret række har vist sig at reducere beskadigelse af fluorescerende proteiner og bevare deres fluorescerende signal for multiphoton billeddannelse. 4. Brug en optimeret fremgangsmåde til optisk clearing med ethanol-baseret dehydrering og clearing af Babbmens afskærmet fra lys, viser vi høj opløsning multiphoton billeder af gult fluorescerende protein (YFP) ekspression i neuronerne i en musehjerne mere end 2 mm neden under vævsoverfladen.

Protocol

1. Animal Perfusion 5 og Whole Mouse Brain Clearing Hele længden af ​​proceduren kan variere afhængigt af, hvor lang tid anvendt pr dehydratiseringstrin, men i alt hele processen kan udføres i to dage. Afvej YFP mus og derefter dybt bedøve med en intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Bekræft et kirurgisk plan af dyb anæstesi før man går videre til kirurgi. Kontroller dyret hver 5 min for at se om den reagerer på en fast tå eller …

Discussion

Mens standard organiske farvestoffer er kompatibel med en række af organiske opløsningsmidler, og derfor ikke udgør en særlig udfordring for clearing protokoller, fluorescerende proteiner er ofte mindre tolerante over for ændringer i opløsningsmiddel. 4 Målet med det foreliggende arbejde var at overvinde en alvorlig begrænsning af tidligere optiske clearing protokoller, hvor fluorescens af XFPs blev tabt eller alvorligt forringet. De billeder, der er præsenteret her, viser, at fluorescens fra YFP ble…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Jacob Solis for hans assistance i videoredigering.

Dette arbejde blev finansieret delvist af en NSF KARRIERE Award DBI-0953902 til MJ Levene.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Inc. D8537 500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol American Bioanalytical AB00515-00500 500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol Pharmco Products, Inc. 111000190 1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich, Inc. 402834 500 ml, 99+%
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich, Inc. B6630-IL 500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective Nikon AZ Plan Flour 5X 15 WD

References

  1. Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
  2. Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
  3. Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
  4. Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
  5. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
  6. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
  7. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  8. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).

Play Video

Cite This Article
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).

View Video