Summary

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

Published: September 23, 2012
doi:

Summary

全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの​​脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合:安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。

Abstract

全体マウス器官の固有蛍光と第二高調波発生(SHG)の多光子顕微鏡は、光学イメージング前器官をクリアすることによって実現されています。1,2しかし、このようなGFPとYFPなどの蛍光タンパク質を含む器官、メタノールを使用した光クリアプロトコルのベンジルアルコールを使用して脱水およびクリアライト3から保護されていないながら、安息香酸ベンジル(Babbの)は、蛍光シグナルを保持しません。ここで紹介するプロトコルは、神経細胞で発現YFPの蛍光シグナルを保持したまま、マウスの脳で臓器全体の光のクリアを実行するためにした斬新な方法です。臓器が蛍光タンパク質へのダメージを軽減し、多光子イメージングのための彼らの蛍光シグナルを維持するために発見されているエタノール傾斜シリーズを用いて脱水であること、このような光学決済プロトコルを変更すること。4エタノールベースの脱水と光学清算の最適化された方法を使用するとBabbのでクリア遮光しながら、我々は、組織表面の下に2ミリメートル以上のマウスの脳のニューロンにおける黄色蛍光タンパク質(YFP)式の高解像度多画像を示す。

Protocol

1。動物灌流5と全体のマウス脳のクリア手続きの全体の長さは、脱水工程ごとに使用される時間の長さによって異なりますが、合計で全体のプロセスは2日間で実施することができる。 YFPマウスを計量してから、深くケタミン/キシラジン(100 mg / kgを10 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔。 手術に進む前に、深い麻酔の外科プレーンを確認します。動物にそれがしっか?…

Discussion

標準的な有機色素は、有機溶媒の範囲と互換性があり、したがって、プロトコルをクリアするために特定の課題を提起していませんが、蛍光タンパク質は、溶媒中に変更されることが多いの耐性が低下します。本研究の4つの目標は、重大な限界を克服することであったXFPを蛍光が消失または著しく低下していた以前の光学クリアプロトコル。ここで提示されている画像はYFPの蛍光が?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、ビデオ編集の彼の支援のためにヤコブソリスに感謝したいと思います。

この作品は、MJのレーベンへのNSFキャリア賞、DBI-0953902によって部分的に資金を供給された。

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Inc. D8537 500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol American Bioanalytical AB00515-00500 500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol Pharmco Products, Inc. 111000190 1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich, Inc. 402834 500 ml, 99+%
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich, Inc. B6630-IL 500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective Nikon AZ Plan Flour 5X 15 WD

References

  1. Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
  2. Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
  3. Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
  4. Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
  5. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
  6. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
  7. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  8. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).

Play Video

Cite This Article
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).

View Video