Summary

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Published: September 23, 2012
doi:

Summary

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Abstract

Microscopia Multiphoton de geração de fluorescência intrínseca e segunda harmónica (SHG) de órgãos inteiros de rato é possível graças opticamente limpeza do órgão, antes de imagem. 1,2 No entanto, para os órgãos que contêm proteínas fluorescentes, tais como GFP e YFP, protocolos de compensação ópticos que usam metanol desidratação e clara usando álcool benzílico: benzoato de benzila (BABB) enquanto desprotegido de 3 luz não preservam o sinal fluorescente. O protocolo aqui apresentado é uma nova forma em que para realizar compensação órgão inteiro óptico no cérebro do rato, preservando o sinal de fluorescência de YFP expressa em neurónios. A modificação do protocolo de compensação óptica de tal modo que o órgão é desidratado usando uma série graduada de etanol foi encontrada para reduzir os danos para as proteínas fluorescentes e preservar o seu sinal fluorescente para imagiologia multifotônica. 4 Utilizando um método optimizado de compensação óptica com base de etanol e de desidratação desmatamento por BABBenquanto protegida da luz, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de proteína fluorescente amarela expressão (YFP), nos neurónios do cérebro de um rato mais de 2 mm abaixo da superfície do tecido.

Protocol

1. Perfusão Animal 5 e Compensação cérebro inteiro Rato O comprimento total do procedimento podem variar, dependendo do período de tempo utilizado por passo de desidratação, no total, mas de todo o processo pode ser conduzido em dois dias. Pesar ratos YFP e em seguida profundamente anestesiar com uma injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Confirmar um plano cirúrgico de anestesia profunda antes de prosseguir para a cirurgia. Verifiqu…

Discussion

Enquanto padrão corantes orgânicos são compatíveis com uma variedade de solventes orgânicos, e, portanto, não representam um desafio especial para limpar os protocolos, as proteínas fluorescentes são menos tolerantes a mudanças em solvente. 4 O objetivo do presente trabalho foi o de superar uma séria limitação ópticos anteriores protocolos de compensação onde fluorescência de XFPs foi perdida ou seriamente prejudicado. As imagens que são aqui apresentados demonstram que a fluorescência de YF…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Jacob Solis por sua assistência em edição de vídeo.

Este trabalho foi financiado em parte por uma Prêmio CARREIRA NSF DBI-0953902 a MJ Levene.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Inc. D8537 500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol American Bioanalytical AB00515-00500 500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol Pharmco Products, Inc. 111000190 1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich, Inc. 402834 500 ml, 99+%
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich, Inc. B6630-IL 500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective Nikon AZ Plan Flour 5X 15 WD

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Cite This Article
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).

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