Summary

Многофотонной микроскопии Сбрасывается мозга мыши выражая YFP

Published: September 23, 2012
doi:

Summary

Многофотонной микроскопии целые органы мыши можно оптически очистка органа перед изображениями, но не все протоколы сохранить флуоресцентного сигнала флуоресцентных белков. Использование оптического метода очистки этанола на основе обезвоживания и бензиловый спирт: бензилбензоат очистки, мы показываем высоким разрешением изображения многофотонной весь мозг мыши выражения YFP.

Abstract

Многофотонной микроскопии собственной флуоресценции и генерации второй гармоники (SHG) целых органов мышей стало возможным благодаря оптическим очистка органа перед изображениями. 1,2 Однако, для органов, которые содержат флуоресцентные белки, такие как GFP и YFP, оптический протоколы очистки, которые используют метанол обезвоживания и ясно использованием бензилового спирта: бензил бензоат (Babb), а незащищенные от светло-3 не сохранить флуоресцентного сигнала. Протокол, представленные здесь, новый способ, в котором для выполнения целого органа оптического просветления на мозг мыши, сохраняя при этом сигнал флуоресценции от YFP выражается в нейронах. Изменение оптических протокол очистки, что орган обезвоживается использования этанола градуированных серии была найдена, чтобы уменьшить ущерб для флуоресцентных белков и сохранения их флуоресцентный сигнал для работы с изображениями многофотонная. 4 Использование оптимизированного метода оптической очистке этанола на основе обезвоживания и очистка от Babbв то время как защищено от света, мы показываем высокое разрешение изображения многофотонной желтый флуоресцентный белок (YFP) выражение в нейронах мозга мышей более чем на 2 мм ниже поверхности ткани.

Protocol

1. Животное Perfusion 5 и всего посредничества мозга мыши По всей длине процедура может меняться в зависимости от времени использовались в обезвоживании шаг, но в целом весь процесс может быть проведен в течение двух дней. Взвешивание YFP ​​мышей, а затем глубокую анестезию ?…

Discussion

В то время как стандартные органические красители, совместимые с различными органическими растворителями, и, следовательно, не представляют собой особую проблему для очистки протоколов, флуоресцентные белки часто являются менее терпимы к изменениям в растворителе. 4 Целью наст?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Якова Солисом за помощь в редактировании видео.

Эта работа была частично финансируется за счет премии NSF КАРЬЕРА DBI-0953902 для MJ Левин.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Inc. D8537 500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol American Bioanalytical AB00515-00500 500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol Pharmco Products, Inc. 111000190 1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich, Inc. 402834 500 ml, 99+%
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich, Inc. B6630-IL 500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective Nikon AZ Plan Flour 5X 15 WD

References

  1. Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
  2. Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
  3. Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
  4. Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
  5. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
  6. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
  7. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  8. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).

Play Video

Cite This Article
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).

View Video