मंजूरी माउस YFP व्यक्त मस्तिष्क के multiphoton माइक्रोस्कोपी
Summary
पूरे माउस अंगों के Multiphoton माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकली इमेजिंग से पहले अंग समाशोधन द्वारा संभव है, लेकिन नहीं सभी प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने. इथेनॉल आधारित निर्जलीकरण और benzyl शराब के साथ एक ऑप्टिकल समाशोधन विधि का प्रयोग: बेंजाइल बेंजोएट समाशोधन, हम पूरे माउस मस्तिष्क YFP व्यक्त की उच्च संकल्प multiphoton छवियों को दिखाने के.
Abstract
पूरे माउस अंगों की आंतरिक प्रतिदीप्ति और 2 हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) के multiphoton माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकली इमेजिंग पहले अंग समाशोधन द्वारा संभव बनाया है. 1,2 हालांकि, अंगों कि GFP और YFP में फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते, ऑप्टिकल समाशोधन प्रोटोकॉल है कि मेथनॉल का उपयोग के लिए निर्जलीकरण और स्पष्ट benzyl शराब का उपयोग: benzyl benzoate (Babb) जबकि 3 प्रकाश से असुरक्षित फ्लोरोसेंट संकेत संरक्षित नहीं है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक उपन्यास में जिस तरह प्रदर्शन करने के लिए माउस मस्तिष्क पर पूरे अंग ऑप्टिकल समाशोधन जबकि YFP न्यूरॉन्स में व्यक्त की प्रतिदीप्ति संकेत के संरक्षण है. ऑप्टिकल समाशोधन ऐसी है कि अंग निर्जलित एक इथेनॉल वर्गीकृत श्रृंखला का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन को नुकसान को कम करने के लिए और उनके multiphoton इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने के लिए पाया गया है प्रोटोकॉल बदलकर 4 इथेनॉल आधारित निर्जलीकरण के साथ ऑप्टिकल समाशोधन के एक अनुकूलित पद्धति का उपयोग करके और Babb द्वारा समाशोधनजबकि प्रकाश से परिरक्षित, हम ऊतक सतह के नीचे एक माउस 2 मिमी से अधिक मस्तिष्क के न्यूरॉन्स में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति (YFP) के उच्च संकल्प multiphoton छवियों को दिखाने के.
Protocol
Discussion
जबकि मानक कार्बनिक रंजक कार्बनिक सॉल्वैंट्स की एक सीमा के साथ संगत कर रहे हैं, और इसलिए प्रोटोकॉल समाशोधन के लिए एक विशेष चुनौती पैदा नहीं करते, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अक्सर परिवर्तन की कम सहिष्णु विलायक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम याकूब Solis वीडियो संपादन में उसकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस काम के हिस्से में एक NSF कैरियर एम.जे. Levene पुरस्कार DBI-0953902 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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