Summary
Kvaliteten hos mus embryonala fibroblaster (MEF) bestäms av den högra musstam såsom CF-1. Pluripotens-stödjande MEF och konditionerat medium (CM) som erhållits från dessa bör innehålla optimala koncentrationer av Aktivin A, Gremlin och Tgfβ1 behövs för Activin / Nodal och FGF vägar till kooperativt hålla självförnyelse och pluripotens.
Abstract
I allmänhet (hiPSCs) humana embryonala stamceller (hESCs) och humana inducerade pluripotenta stamceller 1 kan odlas under varierande förhållanden. Det är dock inte lätt att skapa ett effektivt system för odling av dessa celler. Eftersom odlingsbetingelser kan påverka genuttryck som ger pluripotens i hESCs och hiPSCs är optimering och standardisering av odlingsmetoden avgörande.
Upprättande av hESC linjer beskrevs först genom användning av MEF som matarceller och fetalt bovint serum (FBS)-innehållande odlingsmedium 2. Därefter FBS ersattes med knockout serumersättning (KSR) och FGF2, vilket ökar spridningen av hESCs 3. Slutligen, matare-fria kultur gör det möjligt för odling av celler på Matrigel-belagda plattor i KSR-innehållande medium (medium beroende av MEF) 4. Därefter har hESCs odlingsbetingelser rört sig mot feeder-fri kultur i kemiskt tydligt definieraed förhållanden 5-7. Dessutom har för att undvika eventuella föroreningar av patogener och animaliskt protein kultur metoder med xeno-fria komponenter fastställts 8.
För att få förbättrade villkor mus feeder celler har ersatts med humana cellinjer (t.ex. foster muskel-och hudceller 9, vuxna hudceller 10, förhudsfibroblaster 11-12, amniotiska mesenkymala celler 13). Emellertid är effektiviteten hos bibehålla odifferentierade hESCs med användning av humant förhudsfibroblast-härledda matarskikt inte så hög som den från musceller feeder på grund av den lägre nivån av utsöndring av Aktivin A 14. Uppenbarligen finns det en uppenbar skillnad i tillväxtfaktor produktion av mus-och humana matarceller.
Analyser av transcriptomes av mus-och humana celler feeder avslöjade signifikanta skillnader mellan stöd-och icke-stödjande celler. Exogena FGF2 är avgörande för bibeNing självförnyelse av hESCs och hiPSCs och har identifierats som en viktig faktor som reglerar uttrycket av Tgfβ1, Activin A och Gremlin (en BMP-antagonist) i matarceller. Aktivin A har visat sig inducera uttryck av Oct4, SOX2, och NANOG i hESCs 15-16.
För långsiktig kultur kan hESCs och hiPSCs odlas på mitotiskt inaktiverat MEF eller under matare-fria förhållanden i MEF-CM (MEF-konditionerat medium) på Matrigel-belagda plattor för att behålla sin odifferentierade tillstånd. Framgång för både odlingsbetingelser beror helt på kvaliteten på feeder celler, eftersom de direkt påverkar tillväxten av hESCs.
Här presenterar vi en optimerad metod för isolering och odling av mus embryonala fibroblaster (MEF), förberedelse av konditionerat medium (CM) och enzym-linked immunosorbent analys (ELISA) för att bedöma halterna av Aktivin A inom media.
Protocol
1. Isolering av mus embryonala fibroblaster (MEF)
De följande två stegen utförs under icke-aseptiska betingelser.
- Offra en gravid mus (CF1, Harlan, USA) på 13 eller 14 DPC (dag efter coitus) genom halshuggning.
- Dissekera de livmoderhornen, kortvarigt i 70% (volym / volym) etanol och placeras i en Falcon-rör innehållande PBS utan Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen).
Följande steg utförs i en vävnadskultur huva under aseptiska förhållanden och med sterila instrument.
- Placera livmoderhornen i en petriskål och separera varje embryo från sin placenta och embryonala sac.
- Dissekera huvudet och röda organen, tvätta i PBS och placera alla embryon i en ren petriskål. Fint mala vävnaden med användning av ett sterilt rakblad tills det blir möjligt att pipettera.
- Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), inkluding 100 Kunitz-enheter av DNas I (USB), per embryo.
- Överföra den vävnad i en 50 ml Falcon-rör och inkuberas under 15 min vid 37 ° C. Efter varje 5 minuters inkubering, dissociera cellerna genom pipettering upp och ned ordentligt.
- Inaktivera trypsin genom tillsats av ca 1 volym nyberedd MEF medium.
MEF-odlingsmedium (komponenter för att göra 500 ml medium, blandas alla komponenter och filter):
450 ml DMEM, 50 ml FBS (10% (volym / volym)), 5 ml 200 mM L-glutamin (1/100 (volym / volym)), 5 ml penicillin-streptomycin (1/100 (volym / volym)). - Centrifugera cellerna med låg hastighet (300 xg), 5 min, försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i varmt MEF medium.
- Plattan ungefär ett antal celler som är ekvivalent med 3-4 embryon i varje T150 (TPP)-kolv belagda med 0,2% gelatin (gelatin från bovin hud, typ B, Sigma) under 2 timmar. De fibroblaster (P0, passage 0) är de enda celler som har förmåga att fästa till gelatin-belagda kolvar. Helst celler är 80-90% sammanflytande efter 24 timmar och i detta skede en stor del av P0 celler fryses för framtida användning.
- Expandera den återstående T150-kolv (er) av P0 celler odla P3 eller P4, sedan inaktivera och använda som matare för att förnyad utbredning hESCs eller för att producera konditionerat medium (CM).
2. Inaktivering och Plätering MEF (matarceller Framställning)
Alla steg utförs i en vävnadskultur huv under aseptiska betingelser.
- Kappa T150-kolvar med 0,2% gelatin och inkubera vid rumstemperatur under minst 2 timmar.
- Späd mitomycin C i PBS (1 mg / ml) och filtrera.
- Aspirera mediet från MEF och tvätta med PBS utan Ca 2 + Mg 2 +.
- Överför 20 ml medium innehållande 10 | ig / ml av mitomycin C på MEF.
- Inkubera under 2 timmar vid 37 ° C med mitomycin C som innehöll mediet därefter tvätta två gånger med PBS, Trypsinisera, centrifugen (under 5 minuter vid 300 x g) och återsuspendera celler i varmt medium.
- Räkna celler och platta med en densitet av 56.000 celler / cm 2 i T150 kolvar och användas för CM produktion för de följande 6 dagar.
3. Konditionerat medium (CM) Framställning
Alla steg utförs i en vävnadskultur huv under aseptiska betingelser.
- Dagen efter utstrykning inaktiverat MEF vid en densitet av 56,000 celler / cm 2 ersätta MEF-medium med hESC medium (UM okonditionerat medium) (0,5 ml / cm 2) kompletterat med färskt 4 ng / ml av FGF2.
- Samla CM från matar-kolvar efter 24 h inkubation och tillsätt färsk hESC medium innehållande 4 ng / ml av FGF2 till matarna.
- Upprepa denna procedur för de kommande 6 dagarna. Varje dag lagrar in CM vid -20 ° C.
- Efter 6 dagar blanda alla alikvoter av medium och filtret (Corning, 0,22 im, PAS). Göra 50 ml alikvoter och förvaras vid -80 ° C.
- Komplettera CM med ytterligare 4 ng / ml FGF2 innan du lägger till hESCs odlas på Matrigel. </ Li>
4. Mätning av Aktivin A i konditionerade medier (ELISA) 15
- Ta alla prover och reagenser till rumstemperatur.
- Späd infångningsantikropp (Human \ Mouse \ Rat aktivin A MAb, R & D Systems) i PBS med 1% BSA, lägga till mikroplatta (100 pl / brunn) och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Efter 24 h tvättas brunnarna tre gånger med PBST (PBS med 0,05% Tween 20) (300 pl / brunn) och därefter blocket (1% BSA / PBS, 300 | il / brunn) under 1 h vid RT.
- I denna tid framställa en Aktivin A (R & D Systems) standardkurva, inklusive 7 spädningar (koncentration mindre än 30 ng / ml) och blankprov. Den linjära arbetsområde Aktivin A är mellan 0,25 och 32 ng / ml.
- Tillsätt dubbletter av standarder och prover till brunnarna (100 ^ il / brunn) och inkuberas under 2 h vid RT.
- Tvätta brunnarna tre gånger (300 | il PBST).
- Lägg till sekundära (biotinylerad) antikropp (human / mus / råtta Biotinylerad Aktivin A MAb, R & D Systems) (0.25 | ig / ml i 1% BSA / PBS) och inkuberas under 2 h vid RT.
- Tvätta brunnarna tre gånger (300 | il PBST), tillsätt Streptavidin-HRP (utspädd i 1% BSA / PBS, R & D Systems) och inkubera under 20 min vid rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna tre gånger (300 pl PBST), tillsätt 100 pl substratlösning (Quantikine, R & D Systems) och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Tillsätt 100 pl stopplösning (Quantikine, R & D Systems) i varje brunn och blanda försiktigt.
- Uppsättning mikroplattläsare (Molecular Devices Spectra max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) till 450 nm, med våglängden korrigering vid 540 eller 570 nm, för att bestämma den optiska densiteten hos varje brunn.
5. Representativa resultat
Det övergripande syftet med isoleringen förfarandet presenteras i Figur 1. Den typiska morfologin hos hESCs och hiPSCs odlade under olika betingelser visas i fig 2. Morfologi MEF och inaktiverade celler feeder används för att framställa GH presenteras i figur 3. I allmänhet bör cellerna vara sammanflytande 24 timmar efter isolering och redo att frysas eller expanderas. Men ibland kan det ta 2-3 dagar innan de har fått konfluenta kulturer. CM bör vara beredd från celler vid passage 4 och inte senare. Detta är viktigt eftersom primära celler kan endast expanderas under 4-5 passager före inträdet av senescens.
Cytokinet, Aktivin A, anses vara den mest kritiska faktorn som utsöndras av matarceller för stöd av odifferentierade tillväxten av pluripotenta celler 14. Mätning av nivån av Aktivin A i CM (figur 4) är en mycket bekväm kvantitativ analys för att övervaka kvaliteten av MEF.
Figur 1. En schematisk representation av MEF isoleringsförfarandet.
Figur 2. Den typiska morfologin av odifferentierade hESCs odlade i närvaro av (A) matarceller, (B) konditionerat medium och (C) definierat medium. Den typiska morfologin hos hiPSCs odlade i närvaro av (D, E) matarceller.
Figur 3. Den typiska morfologin hos mus embryonala fibroblaster (MEF). (A) Passage 0 (P0) två dagar efter utstrykning / isolering, (B) inaktiverat matarskikt vid en densitet av 56,000 celler / cm. 2
Figur 4. Enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA)-baserade mätningar av koncentrationen av Aktivin A i konditionerat medium (CM) prepared med musembryonala fibroblaster härledda från CF1 musstam. CM uppsamlades under 6 dagar och sedan samman. CM "1" och CM "2" avser olika partier av media och UM till obetingade media. Som funktion av konditionering processen Aktivin A sekretion i mediet genom MEF, Aktivin A är nästan odetekterbara i UM.
Discussion
Det MEF isoleringsförfarandet presenteras här gör det möjligt att inrätta en standardiserad kultur förutsättning för hESCs och hiPSCs. Dessutom ELISA-system användes för att utvärdera cytokinproduktion genom matarceller är en användbar indikator på kvaliteten av de MEF-härledda konditionerade media. Rutinen underhållet av musstammen (CF1) tillhandahålla styrkande fibroblaster är nödvändigt för att undvika sats till sats variation av kultur media. Vidare är det rekommenderat att isolera embryon från flera möss samtidigt för att erhålla en jämn kvalitet hos celler. Visst nyisolerade MEF kan hållas frysta vid P0 och P1. Även inaktiveras MEF kan förvaras fryst i portioner av lämpliga mängder beroende på kraven för cellodling. Vanligen ca 250,000 celler bör pläterades i en enda brunn av en 6-brunnsplatta för att odla hESCs och iPS-celler. Den etablerade och optimeras metod kan rutinmässigt används för att minimera variabiliteten melhyra experiment.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Speciellt tack till Dr Boris Greber för att ställa in Aktivin A ELISA-protokoll som publiceras i Greber et al. 2007. Vi är särskilt tacksamma för Mrs Monica Shevack för att förbereda grafisk översikt. Vi är mycket tacksamma till Dr Heiko Fuchs för all hjälp och värdefulla förslag före och under filmandet. Vi vill tacka alla medlemmar i Adjaye laboratoriet, särskilt Elisabeth Socha för att bibehålla en konstant tillförsel av MEF och CM. Vi erkänner också våra kollegor på djuret anläggningen av MPIMG för deras permanent stöd. Detta arbete har delvis finansierats av Max Planck-sällskapet och [BMBF, licensnummer 0315717A], partner inom ERASysBio + initiativet att stödjas av EU ERA-NET plus i FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
