Summary
Kvaliteten af muse embryonale fibroblaster (MEF) dikteres af den højre musestamme, såsom CF-1. Pluripotency-støttende MEF'er og konditioneret medium (CM) opnået fra disse skal indeholde optimale koncentrationer af Activin A, Gremlin og Tgfβ1 nødvendige for aktivin / Nodal og FGF veje til at co-operativt opretholde selvfornyelse og pluripotency.
Abstract
I almindelighed (hiPSCs) humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller fra 1 kan dyrkes under skiftende forhold. Men det er ikke let at etablere et effektivt system til dyrkning af disse celler. Da dyrkningsbetingelser kan påvirke genekspression, der giver pluripotency i hESCs og hiPSCs, optimering og standardisering af kulturen metoden er afgørende.
Etablering af embryonale linier blev først beskrevet ved hjælp af MEF'er som fødeceller og føtalt bovint serum (FBS)-holdigt dyrkningsmedium 2. Dernæst blev FBS erstattet med knockout serum udskiftning (KSR) og FGF2, som forøger proliferation af hESCs 3. Endelig, arkføder-frie kultur systemer muliggør dyrkning af celler på Matrigelcoatede plader i KSR indeholdende konditioneret medium (medium konditioneret med MEF'er) 4. Efterfølgende har hESCs dyrkningsbetingelser bevæget sig i retning feeder-fri kultur i kemisk uigenkaldelige bilateraleed forhold 5-7. Desuden har for at undgå den potentielle forurening med patogener og animalske proteiner dyrkningsmetoder med xeno-frie komponenter blevet etableret 8.
Til opnåelse af forbedrede betingelser murine feederceller er blevet erstattet med humane cellelinier (f.eks føtalt muskel og hudceller 9, voksne hudceller 10, forhudsfibroblaster 11-12, amniotiske mesenkymceller 13). Imidlertid er effektiviteten af at opretholde udifferentierede hESCs anvendelse af human forhudsfibroblast-afledte fødelag er ikke så højt som fra murine feederceller som følge af lavere sekretion af activin A 14. Der er naturligvis en tydelig forskel i vækstfaktor produktion af muse og humane fødeceller.
Analyser af transcriptomes af muse og humane fødeceller viste signifikante forskelle mellem støttende og ikke-understøttende celler. Exogenous FGF2 er afgørende for maintaiNing selvfornyelse af hESCs og hiPSCs, og er blevet identificeret som en afgørende faktor, der regulerer ekspression af Tgfβ1, Activin A og Gremlin (en BMP-antagonist) i feeder-celler. Activin A har vist sig at inducere ekspressionen af OCT4, SOX2, og NANOG i hESCs 15-16.
Til langsigtet kultur, kan hESCs og hiPSCs dyrkes på mitotisk inaktiverede MEF'er eller under feeder-frie betingelser i MEF-CM (MEF-konditioneret medium) på Matrigel-overtrukne plader for at opretholde deres udifferentieret tilstand. Succes begge dyrkningsbetingelser fuldt afhænger af kvaliteten af foderceller, idet de direkte påvirker væksten af hESCs.
Her præsenteres en optimeret fremgangsmåde til isolering og dyrkning af muse embryonale fibroblaster (MEF) fremstilling af konditioneret medium (CM) og enzym-linket immunosorbent assay (ELISA) for at vurdere niveauerne af activin A i mediet.
Protocol
1. Isolering af muse embryonale fibroblaster (MEF)
De følgende to trin udføres under ikke-aseptiske betingelser.
- Ofre en gravid mus (CF1, Harlan, USA) ved 13 eller 14 DPC (dag efter coitum) ved cervikal dislokation.
- Dissekere de uterine horn, kortvarigt skyllet i 70% (v / v) ethanol og anbringes i en Falcon-rør indeholdende PBS uden Ca 2 + Mg2 + (Gibco, Invitrogen).
De følgende trin udføres i en vævskultur hætte under aseptiske betingelser og med sterile redskaber.
- Placer Uterushornene i en petriskål og adskille hver enkelt embryo fra placenta og embryonale SAC.
- Dissekere hoved og røde organer, vaskes i PBS og placerer alle embryoner i en ren petriskål. Fint hakket vævet ved hjælp af en sterilt barberblad, indtil det bliver muligt at pipettere.
- Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), inkluding 100 Kunitz enheder DNase I (USB), pr embryo.
- Overføres vævet i et 50 ml Falcon-rør og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Efter hver 5 minutters inkubation, dissociere celler ved at pipettere op og ned grundigt.
- Inaktivering af trypsin ved at tilsætte ca 1 volumen af frisk fremstillet MEF medium.
MEF dyrkningsmedium (komponenter til at lave 500 ml af medier, bland alle komponenter og filter):
450 ml DMEM, 50 ml FBS (10% (v / v)), 5 ml 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)), 5 ml penicillin-streptomycin (1/100 (v / v)). - Centrifuger cellerne med lav hastighed (300 xg), 5 min, fjern forsigtigt supernatanten og resuspender cellepelleten i varmt MEF medium.
- Plade omkring en række af celler, som er ækvivalent til 3-4 embryoner i hver T150 (TPP) kolbe overtrukket med 0,2% gelatine (gelatine fra bovin hud, type B, Sigma) i 2 timer. Fibroblasterne (P0, passage 0) er de eneste celler, der har evnen til at fastgøre de gelatine-coatede kolber. Ideelt set, celler er 80-90% sammenflydende efter 24 timer, og på dette tidspunkt en stor del af P0 celler er frosset til fremtidig brug.
- Udvide resterende T150 kolben (r) P0 celler indtil P3 eller P4 og derefter inaktivering og anvendelse som føderne til udpladning hESCs eller til fremstilling af konditioneret medium (CM).
2. Inaktivering og Plating MEF'er (fødeceller fremstilling)
Alle trin udføres i en vævskultur hætte under aseptiske betingelser.
- Coat T150 kolber med 0,2% gelatine og inkuber ved stuetemperatur i mindst 2 timer.
- Fortynd mitomycin C i PBS (1 mg / ml) og filtreres.
- Aspirere medier fra MEF'er og vaskes med PBS uden Ca 2 + Mg2 +.
- 20 ml medium indeholdende 10 ug / ml mitomycin C i MEF'er.
- Inkuber i 2 timer ved 37 ° C med mitomycin C-holdigt medium derpå vaskes to gange med PBS, Trypsinisér, centrifuge (i 5 minutter ved 300 x g) og resuspender cellerne i varmt medium.
- Tæl celler og plade med en tæthed på 56.000 celler/cm2 i T150-kolber og anvendes til CM fremstilling af de følgende 6 dage.
3. Konditioneret medium (CM) Fremstilling
Alle trin udføres i en vævskultur hætte under aseptiske betingelser.
- Dagen efter udpladning inaktiveret MEF'er ved en densitet på 56.000 celler / cm 2 erstatte MEF medium med embryonale medium (UM, ukonditioneret medium) (0,5 ml / cm 2) suppleret frisk med 4 ng / ml FGF2.
- Indsamle CM fra feeder kolber efter 24 timers inkubation, og der tilsættes frisk embryonale medium indeholdende 4 ng / ml af FGF2 til føderne.
- Gentag denne procedure for de næste 6 dage. Hver dag butik opsamlet CM ved -20 ° C.
- Efter 6 dage blande alle alikvoter af medium og filter (Corning, 0,22 um, PAS). Gøre 50 ml portioner og opbevares ved -80 ° C.
- Supplere CM med yderligere 4 ng / ml af FGF2 før tilsætning til hESCs dyrket på Matrigel. </ Li>
4. Måling af activin A i konditionerede medier (ELISA) 15
- Bringe alle prøver og reagenser til stuetemperatur.
- Fortyndet indfangende antistof (Human \ mus \ Rat Activin A MAb, R & D Systems) i PBS med 1% BSA, tilsættes til mikroplade (100 gl / brønd) og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
- Efter 24 timer vaskes brøndene tre gange med PBST (PBS med 0,05% Tween 20) (300 gl / brønd) og derefter blok (1% BSA / PBS, 300 gl / brønd) i 1 time ved stuetemperatur.
- I denne tid fremstille en Activin A (R & D Systems) standardkurve, herunder 7 fortyndinger (koncentration mindre end 30 ng / ml) og blindprøve. Den lineære arbejdsområde af Activin A er mellem 0,25 og 32 ng / ml.
- Tilsættes dubletter af standarder og prøver til brønde (100 gl / brønd) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vaskes pladen tre gange (300 ul PBST).
- Tilsæt den sekundære (biotinyleret) antistof (Human / Mouse / Rat biotinyleret Activin A MAb, R & D Systems) (0.25 ug / ml i 1% BSA / PBS) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vaskes pladen tre gange (300 ul PBST), tilsættes Streptavidin-HRP (fortyndet i 1% BSA / PBS, R & D Systems) og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vaskes pladen tre gange (300 ul PBST), tilsættes 100 pi substratopløsning (Quantikine, R & D Systems) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt 100 ul af stop-opløsning (Quantikine, R & D Systems) til hver brønd, og bland forsigtigt.
- Sæt mikropladelæser (Molecular Devices Spectra Max 250, Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) til 450 nm, med bølgelængde korrektion ved 540 eller 570 nm, for at bestemme den optiske densitet for hver brønd.
5. Repræsentative resultater
Den samlede opbygning af den isolation procedure er vist i figur 1. Den typiske morfologi af hESCs og hiPSCs dyrket under forskellige betingelser er vist i figur 2. Morfologi MEF'er og inaktiverede fødeceller anvendes til at fremstille CM er vist i figur 3. I almindelighed bør cellerne være konfluent 24 timer efter isolering og klar til at blive frosset eller udvides. Men nogle gange kan det tage 2-3 dage før de får sammenflydende kulturer. CM skal fremstilles ud fra celler ved passage 4 og ikke senere. Dette er afgørende, fordi primære celler kun kan udvides til 4-5 passager inden indtræden af ældning.
Cytokinet, Activin A, betragtes som den mest kritiske faktor, der udskilles af fødeceller til støtte for udifferentierede væksten af pluripotente celler 14. Måling af niveauet af activin A i CM (fig. 4) er en meget bekvem kvantitativt assay til at overvåge kvaliteten af MEF'er.
Figur 1. En skematisk repræsentation af MEF'er isoleringsprocedure.
Figur 2. Den typiske morfologi af udifferentierede hESCs dyrket i nærvær af (A) fødeceller, (B) konditioneret medium og (C) defineret medium. Den typiske morfologi hiPSCs dyrket i nærvær af (D, E) fødeceller.
Figur 3. Den typiske morfologi af muse embryonale fibroblaster (MEF). (A) Passage 0 (P0) to dage efter udpladning / isolation, (B) inaktiveret fødelag med en tæthed på 56.000 celler / cm. 2
Figur 4. Enzymbundet immunosorbent assay (ELISA)-målinger af koncentrationen af activin A i konditioneret medium (CM) prepared med muse embryonale fibroblaster afledt fra CF1 musestamme. CM blev opsamlet i 6 dage og derefter samles. CM "1" og CM "2" refererer til forskellige batches af medier og UM til konditionerede medier. Som funktion af konditionering processen Activin A sekretion i mediet ved MEF'er, Activin A er næsten upåviselig i UM.
Discussion
Den MEF'er isoleringsprocedure præsenteret her muliggør etablering af en standardiseret kultur betingelse for hESCs og hiPSCs. Desuden ELISA-system anvendes til at evaluere cytokinproduktion af fødeceller er en nyttig indikator for kvaliteten af MEF-afledte konditionerede medier. Den rutinemæssig vedligeholdelse af musestamme (CF1) tilvejebringelse støtter fibroblaster er nødvendig for at undgå batch til batch variation af kulturmedier. Endvidere anbefales det at isolere embryoner fra flere mus samtidigt for at opnå en ensartet kvalitet af celler. Bestemt frisk isolerede MEF'er kan holdes frosne ved P0 og P1. Også inaktiveres MEF'er kan opbevares nedfrosset i alikvoter af passende mængder afhængigt af kravene til cellekultur. Sædvanligvis ca 250,000 celler bør udpladet i en enkelt brønd i en 6-brønds plade til dyrkning hESCs og iPS celler. Den etablerede og optimeret fremgangsmåde kan anvendes rutinemæssigt til at minimere variabilitet mellem forskelleje eksperimenter.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Særlig tak til Dr. Boris Greber til opsætning af Activin A ELISA-protokol, som blev offentliggjort i Greber et al. 2007. Vi er især taknemmelige for fru Monica Shevack for at forberede den grafiske oversigt. Vi er meget taknemmelige for Dr. Heiko Fuchs for al hjælp og værdifulde forslag før og under optagelserne. Vi vil gerne takke alle medlemmer af Adjaye laboratoriet, især Elisabeth Socha for at opretholde en konstant tilførsel af MEF'er og CM. Vi anerkender også vores kolleger på dyret facilitet i MPIMG for deres vedvarende støtte. Dette arbejde blev delvist finansieret af Max Planck Society og [BMBF; tilskud nummer 0315717A], partnere ERASysBio + initiativet støttes under EU ERA-NET Plus-ordning i FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
