Summary
يوصف ثقافة الخلية الدورية نظام يسمح الخلايا الظهارية في النمو في ظل الظروف الفسيولوجية الناتجة في 3 مد تشكيل مجموع الخلوية. ولدت المجاميع العرض
Protocol
يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات تحت BSL-2 الأوضاع في تدفق رقائقي غطاء محرك السيارة.
1. إعداد تفاعلات الاحيائية STLV
- تجميع مفاعل حيوي STLV وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتنفيذ بروتوكول لضمان إزالة السموم عقم من مفاعل حيوي. تغطية المنافذ المفتوحة مع قبعات luer وملء STLV مع الايثانول 95٪ لمدة 24 ساعة.
- إزالة الإيثانول وملء STLV مع الماء المقطر المعقم لمدة 24 ساعة.
- كرر الخطوة 1.2 مع ماء مقطر معقم فقط.
- مع الأداة التي قدمتها البائعين، وترخي جميع مسامير، والقبعات والمكونات المركز من STLV، والأوتوكلاف على 110 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الحقيبة تعقيم.
- مرة واحدة يتم تبريد STLV، وتشديد الخناق وكرر الخطوات 1،1-1،4 لضمان العقم وإزالة السموم كاملة.
- تشديد الخناق على تبريد STLV والمسمار في الصمامات في اتجاه واحد قبل تعقيمها إلى كل منفذ.
- فتح محبس عن طريق وضع المقابض عموديا.
- إزالة الغطاسون من حقنة 10 مل و 5 مل luer للانغلاق والغطاسون اعادة كم مرة في مغلفة للحفاظ على عقم. المسمار الحقن على الصمامات (مطلوبة المحاقن طرف luer قفل لهذه الخطوة).
- إضافة إلى Dulbecco الفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) إلى الحقنة 10 مل حتى STLV غير كامل، ويبدأ في ملء محقنة 5 مل.
- استبدال الغطاسون معقمة في كل حقنة وإزالة الفقاعات المتبقية التي تحدث في مفاعل حيوي بالتناوب بين القيادة الغطاسون من الحقن.
- ترك الحقن تعلق على مفاعل حيوي بعد إزالة جميع الفقاعات. الصمامات وثيقة ونعلق STLV إلى منصة العمودي الدورية وتدوير مدة لا تقل عن 24 ساعة لمراقبة من وجود تسرب.
2. إعداد الخرز Microcarrier
- إضافة 15 مل DPBS إلى 250 ملغ ~ الخرز microcarrier cytodex في أنبوب مخروطي 50 مل والأوتوكلاف تحت ظروف نفس STLV (1.4).
- بعد التبريد، وإزالة DPBS، إضافة الوسائط المستخدمة لزراعة epitheliآل خلية من الفائدة، وأنبوب إلى دوامة resuspend الخرز.
- تكرار غسل الخطوات مع وسائل الإعلام مرتين أخريين. بعد غسل النهائي إضافة 15 مل من وسائط النمو إلى الخرز.
3. بذر الخلايا الظهارية والخرز في تفاعلات الاحيائية STLV
- تنمو الخلايا الظهارية في المصالح كما monolayers في قوارير زراعة الأنسجة حتى تحصل على 1x10 ≥ 7 الخلايا. إزالة خلايا من القارورة (أي trypinsization، EDTA)، عد الخلايا لتأسيس تركيز الخلوية، وتحديد الجدوى الخليوي عن تلطيخ التريبان الاستبعاد الزرقاء 1.
- إلى أنبوب مخروطي يحتوي على حبات معد سلفا (انظر 2.3)، إضافة تركيز المطلوب من الخلايا (2x10 1x10 5-7 الخلايا الظهارية) 2، 8، اعتمادا على نوع الخلايا الظهارية للنوايا (الشكل 1A). ضمان أن يتم نقل جميع الخلايا وذلك بدهن أنبوب مخروطي الشكل.
- إزالة DPBS والمحاقن من STLV.
- إزالة المكونات من ميناء مركز وإضافة ج الظهاريةELL / التعليق حبة في STLV باستخدام 10 مل ماصة المصلية. شطف أنبوب مخروطي لضمان أن يتم نقل جميع خلايا / حبات لSTLV واستبدال مركز ميناء قابس.
- إزالة الغطاسون من المحاقن مل 1 5 و 10 و الغطاسون اعادة كم مرة في مغلفة للحفاظ على عقم. المسمار الحقن في الموانئ مع الصمامات مفتوحة. ملء STLV مع وسائل الاعلام، استبدال الغطاسون، والصمامات وثيق.
- وضع STLV المصنف حديثا في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع عدم وجود دوران.
- الصمامات مفتوحة، وإزالة الفقاعات باستخدام الغطاسون، ثم الصمامات وثيق.
- وضع STLV في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الدورية حاضنة مرطب في 20 دورة في الدقيقة (الشكل 1B). ويجب أن الثقافات تناوب مستمر 24 يوم هكتار باستثناء وسائل الاعلام، عندما أخذ العينات المتغيرة، أو المجاميع الحصاد (انظر القسم التالي).
4. زراعة، وأخذ العينات، والوثائق والصور من الثقافات
- بعد ساعة 96-120 الأولي من الخلايا زراعة في استقصاء المعلوماتoreactor، ووسائل الإعلام التغيير STLV إمالة والسماح للخلايا / حبات لتسوية. إزالة المحاقن، وفتح الصمامات على حد سواء، وتصب قبالة ~ 75٪ من وسائل الاعلام من جانب المنفذ (الشكل 1C). بناء على الأيض الخلوي من وسائل الإعلام، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم أو كل يوم بعد الغرس الأولي و96-120 فترة ثقافة ح.
- برغي في 5 و 10 مل من فراغ المحاقن الغطاسون ومتابعة بروتوكول اعادة التغذية على النحو المبين أعلاه (1،7-1،11)، المسمار ثم أغلق مرة أخرى STLV في مكان على منصة دوارة.
- رصد النمو والجدوى من المجاميع كل 5-7 أيام بعد البذر في STLV عن طريق إزالة بعناية على كمية صغيرة من الركام (~ 200 ميكرولتر) من ميناء مركز في أنابيب 1.5 مل 2. لتجنب القص الكلي، لجميع التحويلات الإجمالية استخدام 1000 رأس ماصة ميكرولتر أنه تم خفض ~ 2 سم من نقطة وتعقيمها.
- استبدال المكونات مركز، مع تبادل المحاقن جديد، إضافة وسائط جديدة لSTLV كما هو موضح أعلاه (1،7-1،11)، ووضع الظهر في STLVحاضنة مع دوران (انظر 3.8).
- لرصد جدوى الخلوية، واستخدام واحد من اثنين 1.5 المجاميع أنبوب مل aliquoted في الخطوة 4.3، وإزالة الخلايا من الخرز بنفس الطريقة يتم إزالة الخلايا الظهارية من قوارير زراعة الأنسجة (أي trypsinization). مراقبة صلاحية إقصاء بواسطة أزرق التريبان تلطيخ 1.
- بالنسبة للمجاميع التصوير الخلوية، إضافة 0،5-1 مل من وسائل الإعلام إلى قسامة 2 1.5 مل تجميع ونقل إلى صحن بيتري صغير باستخدام قطع رأس 1000 ماصة ميكرولتر. المجاميع صورة باستخدام مجهر الضوء المعكوس (1D الشكل).
5. نقل وحصاد المجاميع
- بالنسبة لبعض نماذج الخلايا الظهارية من الضروري لنقل الحصى إلى حارف المتاح لزيادة التهوية ثقافة 2. ما يقرب من أسبوع واحد قبل حصاد المجاميع للتحليل، وإزالة المحاقن والصمامات من STLV وتصب قبالة ~ 50٪ من وسائل الاعلام من جانب المنفذ.
- REMاوفه توصيل STLV الوسط ويسكب بعناية جميع محتويات في أنبوب 50 مل مخروطي من ميناء المركزية (الشكل 1E). شطف STLV مرتين مع وسائل الإعلام 5 مل والجمع بين شطف مع بقية المجاميع.
- تواصل مع نقل الركام كما هو موضح في 5.2، ولكن نقل الركام من أنبوب 50 مل مخروطي لحارف.
- تم تنفيذ المجاميع الحصاد بعناية من حارف بعد أسبوع 1 ~ أو من STLV (استنادا إلى نوع من الخلايا) على النحو الوارد أعلاه (5.2). انظر أدناه لصيغ فحص المحتملة، وفحوصات وتحليل بعد الحصاد الكلي.
6. تحليل المحتملة، وتطبيقات والمقايسات التي أجريت مع المجاميع
- المجاميع بذر لصيغ تجريبية مختلفة. نقل المقدار المطلوب من الركام من أنبوب للمخروطي 50 مل إلى أنبوب 1.5 مل، 24 لوحة جيدا، أو 96 لوحة جيدا باستخدام قطع تعقيمها 1000 رأس ماصة ميكرولتر (الشكل 1F).
- الغسيل وpreparجى المجاميع لتحليلها. وسائل الاعلام بعد إزالة الركام واستقر. الاستغناء DPBS مباشرة إلى مركز للأنبوب أو جيد جدا وأثار كل المجاميع التي تصل. مرة واحدة المجاميع قد استقروا على أسفل، وإزالة DPBS وكرر عدة مرات حسب الحاجة.
- المجاميع الشحن للخارج الموقع التجريب والتحليل. إضافة المبلغ المطلوب من الركام إلى أنبوب 50 مل وغسل الركام كما في 6.2. ملء تماما أنبوب 50 مل مع وسائل الاعلام، وكأب، وparafilm حول الغطاء لتجنب تسرب. السفينة بأمان المجاميع إلى الموقع المطلوب بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المحيطة.
- تحديد المجاميع لالمجهر الإلكتروني (الشكل 2). ويمكن إجراء المسح الضوئي، أو انتقال المجهر المناعية الإلكترون من خلال نقل المجاميع 150-300 ميكروليتر إلى أنبوب 1.5 مل وغسل الركام 3 مرات مع DPBS (6.2). إضافة 200 ميكرولتر من بالتطبيق (SEM، TEM، المناعية EM، الخ.) الإلكترون مثبت المجهري للفترة حضانة المطلوب. إزالة إصلاح، وغسل aggregatوفاق 2 مرات مع DPBS، والمضي قدما على النحو المبين في هيلم وآخرون عام 2010 لمسح وانتقال المجهر الإلكتروني 2.
- المناعي التصوير المجهري (الشكل 3). نقل الركام ~ 100 ميكروليتر إلى أنبوب 1.5 مل وغسل الركام (6.2). تحديد وتسمية المجاميع مع الأجسام المضادة في ظل ظروف مماثلة كما هو الحال مع monolayers، ما عدا في أنبوب 1.5 مل. في التصاعد، وضع 1 قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة على شريحة المجهر، نقل الركام المسمى على رأس وسائل الإعلام مع تزايد احتمال قطع رأس 1000 ماصة ميكرولتر، ساترة مكان أكثر من المجاميع، وختم ساترة مع طلاء الأظافر، والانزلاق الجاف بين عشية وضحاها 2.
- قياس الجدوى الخلوية / انتشار استخدام MTT فحص (الشكل 4). المجاميع نقل إلى لوحة البئر 24 و يحل محل وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام الحمراء 625 ميكرولتر الفينول الحرة. إضافة 62.5 ميكرولتر من 5 ملغ / مل Thiazolyl الأزرق Tetrazolium الميثيل (MTT) إلى كل جيدا، واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية. إضافة 625 ميكرولتر من 100 ملغ / مل SDS-0.01M حمض الهيدروكلوريك إلى كل جيدا، واحتضان بين عشية وضحاها. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر، والحصول على٪ بقاء الخلية باستخدام المعادلة التالية:
- علم السموم دراسات. نقل الركام الى 24 لوحة وأداء جيد التريبان الاستبعاد الزرقاء على الآبار 2 ≥ لبقاء الخلية الأولي / تركيز. إضافة مركب اختبار في تركيزات تتراوح بين تكرار الآبار. لبقاء الخلية (الشكل 5A)، ويغسل الحصى وأداء استبعاد أزرق التريبان بعد العلاج. لTC 50 (الشكل 5B)، واتخاذ جدوى الخلوية من الآبار مكررة لكل تركيز مع مرور الوقت واستخدام ريد مونش طريقة لتحديد تركيز السامة بنسبة 50٪ 2، 15.
- حبة مجموعة Cytometric (CBA) أو ELISA. ويمكن اتخاذ supernatants الخلوية بعد بذر خلايا في أي شكل تخطيطي تجريبي. حفز المجاميع المصنف كما هو الحال مع الخلايا كما نمتmonolayers، جمع supernatants (≥ 120 ميكرولتر)، ومخزن في -80 درجة مئوية لتحليلها من قبل ELISA أو CBA (الشكل 6).
- تحليل الحمض النووي الريبي. نقل ≥ 500 ميكرولتر من الركام إلى أنبوب 1.5 مل وغسل الركام مع DPBS. تواصل استخراج باستخدام QIAGEN RNAeasy عدة وبروتوكول للخلايا الحيوانية مع تجانس المحللة باستخدام مقياس 20 إبرة. تأكد من السماح لحبات تسوية في أسفل الأنبوب، وذلك قبل نقل طاف، وعدم نقل حبات فارغة إلى عمود الدوران (الخرز وسوف تسد غشاء العمود مما أدى إلى انخفاض العائد الحمض النووي الريبي) (الشكل 7).
- تحليل البروتين. المجاميع الحصاد تحت نفس الأساليب كما هو الحال مع monolayers باستخدام أنبوب 1.5 مل أو شكل أكبر التجريبية. ومع ذلك، بعد تحلل من الركام، والسماح حبات لتسوية ونقل المحللة إلى أنبوب منفصل قبل تشغيل هلام بروتين أو أي شكل آخر من تحليل البروتين (الشكل 8).
- عدوىدراسات. مجاميع البذور في شكل تجريبي المطلوب. استخدام اثنين على الأقل من الآبار / عينات لخلايا trypsinizing من الخرز تعداد عدد الخلية وتحديد بقاء الخلية. تصيب المجاميع مع الممرض من مصلحة في تعدد مختارة من العدوى على النحو الذي قام مع الخلايا المزروعة كما monolayers (الشكل 9). يجب تنفيذ خطوات غسل كما في 6.2.
- التدفق الخلوي: مجاميع البذور في أنبوب 50 مل، والمجاميع غسيل (6.2)، وإضافة 2MM EDTA ل5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة الوسائط مل 5-10 إلى الخلايا والخلايا تمر من خلال مصفاة الخلية. قسامة 1x10 6 خلايا في أنبوب البولي بروبلين والخلايا في غسل الباردة حل حجب (1٪ FBS في برنامج تلفزيوني). Resuspend الخلايا مع الأجسام المضادة واحتضان فقا للشركة المصنعة. غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي، resuspend في برنامج تلفزيوني، وخلايا لتصفية نقل أنبوب للتحليل (الشكل 10).
7. ممثل النتائج
مثاليمكن رؤية متباينة إجمالي الظهارية البشرية التي تزرع في نظام مفاعل حيوي STLV في الشكل 2. يتم تجميع الصور ووزارة شؤون المرأة وتيم من الخلايا المهبلية الإنسان التي تزرع في STLV لمدة 39 يوما، حيث يمكن ملاحظة microridges، invaginations، حويصلات إفرازية داخل الخلايا، وزغيبات على السطح القمي. ويمكن ملاحظة مظاهرة أخرى من الجسم الحي في مثل خصائص الخلايا الظهارية التي تزرع في مفاعل حيوي بواسطة مبائر الصور المجهري المناعي (الشكل 3) من 3-D الخلايا المهبلية معربا عن الميوسين (MUC1)، وعلامات محددة لالخلايا الظهارية (ESA) والمفاضلة النهائية (Involucrin؛ INV).
كما هو مبين، 3-D المجاميع عرض ملامح التركيبية مماثلة لأنسجة، ولكن على نحو أكثر الظواهر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أيضا بمثابة منصة ممتازة لتقييم سمية من المركبات. فحص MTT، وهو فحص تستخدم عادة لقياس بقاء الخلية، والتمثيل الغذائي أو proliferaنشوئها، ويمكن استخدامها لقياس السمية للمواد الكيميائية المختلفة ومركبات (الشكل 4). وقد استخدم تريتون X-100، والمنظفات التي تدمر الأغشية الخلوية، كعنصر تحكم إيجابية للتحقق من صحة فحص MTT. وسيلة إضافية لقياس سمية بعد العلاج مع مركبات الاختبار هو التريبان الزرقاء الاستبعاد (الشكل 5). بعد العلاج مع 9-نونوكسينول (N-9)، برهنت على المجاميع المهبلية استجابة سمية مماثلة لتلك النماذج يزدرع عنق الرحم، لكن ملف تعريف مختلف مقارنة monolayers 2 و 16.
ويمكن ملاحظة أن دراسات إضافية تثبت قدرة الخلايا الظهارية، ونمت في مفاعل حيوي، لتعمل على نحو مماثل، ويشير إلى الأنسجة في الجسم الحي، في الشكل (6). على التحفيز مع الجزيئات المستمدة من الميكروبات التي يتم التعرف عليها بواسطة مستقبلات تول مثل (TLR)، والمجاميع الاستجابة وتفرز السيتوكينات الموالية للالتهابات، بما في ذلك IL-6 1.ويمكن أيضا التعبير عن مستقبلات هرمون البروجسترون (العلاقات العامة)، ومستقبلات تستجيب لتحفيز هرمون، يتعين مراعاتها في خلايا المهبل في كل من الحمض النووي الريبي ومستويات بروتين (الشكل 7 و الشكل 8، على التوالي). المجاميع 3-D ليس فقط القدرة على الاستجابة لجزيئات العوامل المسببة للأمراض، والهرمونات، ولكن هي أيضا قادرة على دعم وظيفيا 1 الهربس البسيط من النمط 2 (HSV-2) إصابة. صورة متحد البؤر المجهري من HSV-2 المجاميع المصابة المهبل 3-D (الشكل 9) يدل على عدوى. لا تظهر مواز 2-D المهبلية الثقافات الخلايا الظهارية نتيجة لتدمير الخلايا الشديدة التي تسببها عدوى-2 هامبورغ. كما تم RWV المستمدة من 3-D الركام المستخدمة لقياس تكرار البكتيرية والفيروسية من خلال منحنيات النمو داخل الخلايا والمقايسات لوحة، على التوالي 8 و 9. وأخيرا، يمكن أيضا أن الخصائص الفيزيائية والوظيفية للخلايا فردية ضمن المجاميع يكون كميا بواسطة التدفق الخلوي. لأمثلجنيه، ويعمل لدينا فحص التدفق الخلوي لقياس MUC1 التعبير على سطح خلايا المهبل الفردية (الشكل 10). وأعرب عن طريق المهبل المجاميع 3-D نسبة أقل من MUC1 (27.7٪) مقارنة monolayers (67.2٪). قد خفض نسبة MUC1 على السطح المجاميع 3-D مقارنة monolayers يكون نتيجة لغالبية MUC1 التي تفرز من الخلايا كما لوحظ في القناة المهبلية 17 و 18.
الشكل 1. التخطيطي للخلايا الظهارية زراعة الإنسان في RWV والتطبيقات المحتملة باستخدام RWV المستمدة من الركام. A) وتزرع في البداية الخلايا الظهارية كما monolayers في نسيج الثقافة قارورة. متكدسة مرة واحدة، يتم إزالة الخلايا من قارورة وجنبا إلى جنب مع حبات microcarrier في مفاعل حيوي STLV. شريط الحجم: 80 ميكرومتر B) وSTLV بالتناوب على منصة لخلق بيئة ثابت من السقوط الحر و منخفضةويجب تغيير luid القص، والسماح للخلايا لنعلق وتنمو على الخرز وبالتالي تكوين المجاميع الخلوية مرئية. ج) بعد 96 ساعة، وسائل الإعلام في STLV لاستيعاب لالأيض الخلوي. يسكب في وسائل الاعلام من جانب منفذ، يتم استبدال وسائل الإعلام الجديدة من خلال حقنة المرفقة مل 10 (الغطاس إزالة)، ويتم استبدال الغطاسون حقنة وتستخدم لقذف فقاعات. D) وبعد أيام 5 ~ (د) وتبدأ على شكل مجاميع . يتم أخذ عينات من الركام كل 7 أيام، والتقط بواسطة المجهر الضوئي لرصد تطور نموهم (20x والتكبير من 3-D الخلايا الظهارية الإنسان المهبلية). E) وبمجرد تشكيل مجموع كاملة وتمايز الخلايا قد حدث، ويتم حصاد المجاميع من مفاعل حيوي و يمكن المصنف نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. F) المجاميع في أنبوب 1.5 مل أو صيغة لوحة متعددة جيدا لإجراء تحليل تجريبي والمقايسات. G) لمحة عامة عن بوتيه المقايسات ntial والتحليلات التي يمكن أن تجرى على الركام. وليس المقصود هذه القائمة ممثل التحليلات ليكون ضمن قائمة شاملة للجميع التطبيقات المصب المحتملة.
الشكل 2. دراسة الصفات المورفولوجية والهيكلية لل3-D الركام الخلايا الظهارية باستخدام المجهر الإلكتروني. (A) مسح المجهر الإلكتروني (SEM) صورة 3-D الإنسان الظهارية مجموع الخلية المهبلية. الحانات النطاق: 200 ميكرومتر (100X)، و 100 ميكرون (200X)، 50 ميكرومتر (500x). انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) صورة 3-D الإنسان الظهارية مجموع الخلية المهبل مع أسهم تشير إلى (B) حويصلات إفرازية داخل وزغيبات أو (C) "عمليات حشوية". الحانات النطاق: 2 ميكرومتر (معدلة من هيلم وآخرون عام 2010.) 2.
g3.jpg "/>
الشكل 3. المجهري المناعي مبائر المستخدمة لتحديد التمايز موصلي وعلامات البروتين في 3-D الركام الخلايا الظهارية. الإنسان خلايا المهبل 3-D تحصد من مفاعل حيوي بعد 32 يوما، ثابت، والملون مع (أ) الأجسام المضادة الميوسين MUC1، (B) المحدد للجسم المضاد طلائي الخلايا، وكالة الفضاء الأوروبية، أو (C) المضادة للInvolucrin (INV) الأجسام المضادة التي تعترف الخلايا الظهارية متباينة عضال. وصفت بشكل غير مباشر مع الجسم المضاد 488 المجاميع اليكسا الثانوية (الخضراء). شريط الحجم: 60 ميكرومتر (معدلة من هيلم وآخرون عام 2010.) 2.
الشكل 4. ويستخدم MTT فحص لقياس الجدوى الخلوية. الإنسان المجاميع المهبل 3-D وفازت المصنفة 24 في لوحة جيدا والتعامل معها وحدها وسائل الإعلام (غير المعالجة) أو 0.01٪، 0.1٪ أو 1.0٪ تريتون X-100 منظف لمدة 1 ساعة عند 37 درجة C. يلي: · تمت إزالة ز علاج ووسائل الإعلام وأجري فحص MTT لقياس الجدوى الخلوية. ويمثل ** P <0.001، وحيد الطرف الطالب اختبار t مقارنة تريتون X-100 الخلايا المعالجة إلى سيطرة غير المعالجة.
الشكل 5. باستخدام 3-D الركام الخلايا الظهارية لسمية مركب الشاشة. (A) نونوكسينول-9 (N-9) تعتمد على الجرعة منحنى البقاء 24 ساعة في مرحلة ما بعد العلاج من 3-D الإنسان المهبلية نموذج الخلايا الظهارية (خط أحمر / القضبان) مقارنة نفس نوع من الخلايا كما نمت monolayers متموجة (الخط الأسود / القضبان). (B) N-9 TC 50 مستويات من المهبل الثقافات الخلايا الظهارية في ساعة في 1.5 (A)، ح 4، ح 8، و 24 معاملة آخر ساعة. * يمثل ف <0.05، وحيد الطرف الطالب اختبار t مقارنة monolayers إلى الخلايا 3-D في كل مرة تعرض. (معدلة من هيلم وآخرون 2010) 2.
/ files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
الشكل 6. وقد حفزت تحليل من إنتاج السيتوكينات في الخلايا الظهارية 3-D ردا على حصيلة مثل مستقبلات (TLR) التحفيز ناهض. ثلاثة-D الخلايا المهبلية الإنسان مع FSL-1 (TLR2 / 6)، والموافقة المسبقة عن علم (TLR3)، العلم (TLR5) وقيست CL097 (TLR7 / 8) لمدة 24 ساعة والسيتوكينات التي يفرزها مجموعة حبة cytometric. ويرد IL-6 كما خلوى 1 proinflammatory ممثل إنتاجها وقياسها. * يمثل ف <0.05، وحيد الطرف الطالب اختبار t مقارنة عينات لحفز مجموعة PBS. (معدلة من هيلم وآخرون 2010) 2.
الشكل 7. ويظهر الرصد التعبير الجيني في الخلايا الظهارية 3-D. نصف الكمية RT-PCR تحليل من مستقبلات هرمون البروجسترون (العلاقات العامة) في التعبير أحادي الطبقة (ML) أو 3-D الإنسان الخلايا الظهارية المهبلية. GAPDH كعنصر تحكم التحميل. التضخيم المنتجاتأظهرت هي نتيجة للتعبير عن نص وقعت بعد دورات PCR 30. السهم يرأس نقطة إلى نطاقات العلاقات العامة التي تحدث فقط في العينة 3-D.
الرقم 8. وبحث بروتين تحليل التعبير عن 3-D الخلايا الظهارية. الغربية تحليل لطخة من أحادي الطبقة و 3-D المهبلية الظهارية الإنسان lysates خلية خلية كاملة (30μg) مع مستقبلات المضادة للهرمون البروجسترون (العلاقات العامة) الأجسام المضادة. وقد استخدم β-تويولين كما تحقيقا لتحميل مراقبة.
الشكل 9. ثلاث-D الإنسان نموذج الخلايا الظهارية يدعم عدوى فيروسية الإنتاجية. متحد البؤر المجهري صورة المناعي من 3-D الإنسان المهبلية مجموع الخلايا الظهارية المصابين HSV-2. أصيب الخلايا في 1 وزارة الداخلية من 1.0 لمدة ساعتين،، ثابت غسلها آخر 24 ساعة إصابة (4٪ PFA)، وملطخة 1 ج VP5 HSV-2 محددapsid الأجسام المضادة (الخضراء) ودابي النووية وصمة عار (الأزرق). مقياس شريط: 50 ميكرون.
الرقم 10. فرد تحليل الخلية في 3-D الإنسان نموذج الخلايا الظهارية بواسطة التدفق الخلوي. (أ) تم أحادي الطبقة أو (B) 3-D المجاميع البشرية الظهارية المهبلية فصلها مع EDTA، وصفت مع الأجسام المضادة MUC1 مترافق FITC (الأزرق)، وسيطرة isotype (الأخضر)، أو برنامج تلفزيوني (الحمراء)، وكان التعبير كميا بواسطة FITC تدفق الخلوي. الأرقام تمثل نسبة مئوية من الخلايا التي تلطخ إيجابية للأجسام المضادة الميوسين التي بقيت بعد المعزولة خارج مضان الخلفية من الخلايا سيطرة isotype الملون. غير موحدة القمم هي نتيجة لتعدد أنماط glycosolation ومستويات متفاوتة من MUC1 على سطح هذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد الاستفادة من تكنولوجيا مفاعل حيوي RWV المقدمة هنا توفر للباحثين لديها القدرة على دفع ثقافتهم خلية النظام الحالي لأكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة عضوي النمط ثقافة نموذج الخلية. الخلية مفاعل حيوي RWV نظام ثقافة يوفر المكروية القص المنخفض التي تمكن الخلايا لتشكيل المجاميع الخلوية 3-D في الجسم الحي مع مثل الخصائص، بما في ذلك منعطفات ضيقة، وإنتاج الميوسين، والعمليات خارج الخلية (أي زغيبات)، وقطبية الخلوية. غالبية البيانات والأمثلة المقدمة هنا تستخدم الخلايا الظهارية المهبلية تزرع في نظام RWV، ولكن نظام RWV أيضا استخدمت لثقافة أخرى أنواع الخلايا الظهارية بما في ذلك الأمعاء الصغيرة والكبيرة والرئة والمثانة، والكبد، والخلايا الظهارية لوزة تشكيل 3-D نماذج عضوي النمط 1، 7-13، 18. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا النظام لأنواع الخلايا ثقافة أخرى من الخلايا الظهارية، وحاليا وضع معقد، multicellular نماذج ثقافة عضوي النمط جارية 2 و 18.
الخطوط العريضة لبروتوكولات هنا يقصد بها أن تكون بمثابة دليل، وربما تحتاج إلى تعديل استنادا إلى نوع من الخلايا في المصالح. التعديلات الأكثر شيوعا في البروتوكول لزراعة الخلايا الظهارية في النظام RWV تشمل طول الفترة الزمنية يتم استزراع الخلايا في STLV، قرار وتوقيت نقل الكلي من STLV إلى حارف، ونسبة خلية / حبة لأولي البذر في STLV. تحويرا المتخصصة التي يمكن النظر فيها لتشكيل مجموع الناجحة هي خصائص حبة microcarrier أو سقالة، مثل مساحة السطح، وقطر، والشكل ومواد الطلاء، والكثافة، تهمة، والمواد الأساسية، والمسامية. وبالإضافة إلى ذلك، قد التعديلات على قاعدة ثقافة المتوسط، وصياغة، أو المكملات الغذائية، ويكون من الضروري لتحسين الظروف والثقافة، وتحقيق أقصى قدر من تشكيل مجموع المباراتين. ويمكن أيضا أن التعديلات التي أدخلت على نظام مفاعل حيوي ومكوناته، فيبغرض اختتامها حجم السفينة مفاعل حيوي وسرعة الدوران. لتقييم المعزز للالمكروية داخل مفاعل حيوي، ووضع نظام ثقافة perfused باللغات التي تسمح للرصد المستمر لمستويات الحموضة، الأوكسجين، والجلوكوز داخل وعاء ثقافة ضمان بيئة وافرة لتشكيل مجموع المباراتين. الوقت مطولة محتملة لتحسين الظروف والثقافة، وتشكيل الكلي، والتمايز الخلوي ونظام لتوصيف كل نموذج جديد، وكذلك على حساب الأولي للنظام مفاعل حيوي، هي عيوب يشار إلى هذا النظام. ومع ذلك، فإن أي نظام ثقافة جديدة تنفذ في مختبر لها عيوب مماثلة.
لقد أظهرنا وغيرها من الجهات التي RWV المشتقة من النماذج التي تستخدم الخلايا البشرية يمكن أن تكون أداة قيمة للتنبؤ فعالية، والسمية والدوائية من اللقاحات ومبيدات الجراثيم، والمستحضرات الصيدلانية البيولوجية على نحو وثيق الصلة إلى البشر 1، 2، 18. مع نجاح الهو نظام مفاعل حيوي لانتاج ثقافة أصيلة ردود فعل الإنسان، جنبا إلى جنب مع مرونته، ويتم حاليا في تطبيقات نظام مفاعل حيوي RWV يجري التوسع في مجالات مثل النمذجة الورم، والطب التجديدي، وهندسة الأنسجة 2، 18-23. للمضي قدما لنا RWV ولدت نماذج المخاطية ونحن نعمل لخلق نظام أكثر تعقيدا المتعددة الخلايا أن يعيد كل من هيكل ووظيفة الأنسجة المخاطية الإنسان. ومع ذلك، فإن الكتاب يعترف بأنه قد يكون من الضروري استخدام أو دمج أنظمة متعددة لإعادة إنتاج نموذج التفاعلات المعقدة أن الأدوية أو اللقاحات لديها مع أنظمة الفيزيولوجية البشرية. عموما، وهدفنا من استخدام مفاعل حيوي RWV وتطبيقاته التجريبية من أجل فهم أفضل المخاطية الأنسجة البيولوجية والاستجابات الخلوية لالشتائم البيئية في النماذج عضوي النمط الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر بروك هيلم لخبرتها التقنية وأندرو لارسن لتحليل البروتين له. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من مؤسسة أبحاث التنمية البدائل (MMHK) غرانت والمعاهد الوطنية للصحة المعدية الأمراض المنقولة جنسيا ومضادات الجراثيم الموضعية التعاونية مركز البحوث IU19 AI062150-01 (MMHK). نحن الامتنان بيولوجيا التكاثر لإعادة استخدامها من الشخصيات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
