Summary
घूर्णन सेल संस्कृति प्रणाली है कि उपकला कोशिकाओं शारीरिक 3-D सेलुलर कुल गठन में जिसके परिणामस्वरूप शर्तों के तहत विकसित करने के लिए अनुमति देता है वर्णित है. समुच्चय प्रदर्शन उत्पन्न
Protocol
सभी चरणों को एक लामिना प्रवाह हुड में बीएसएल 2 शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
1. STLV bioreactor तैयारी
- निर्माता प्रोटोकॉल अनुसार STLV bioreactor इकट्ठा और detoxification के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए बायोरिएक्टर की बाँझपन सुनिश्चित. Luer टोपी के साथ खुले बंदरगाहों कवर और 24 घंटे के लिए 95% इथेनॉल के साथ STLV को भरने.
- इथेनॉल निकालें और 24 घंटे के लिए आसुत जल निष्फल के साथ STLV भर.
- 1.2 निष्फल आसुत जल के साथ ही कदम दोहराएँ.
- उपकरण विक्रेता द्वारा आपूर्ति के साथ, 110 ° सी में बंध्याकरण पाउच में 20 मिनट के लिए सभी शिकंजा, टोपियां और STLV से केंद्र प्लग, और आटोक्लेव ढीला.
- एक बार STLV ठंडा है, शिकंजा कसने और बाँझपन और पूर्ण detoxification सुनिश्चित 1.1-1.4 चरणों को दोहराएँ.
- ठंडा और पूर्व निष्फल प्रत्येक बंदरगाह के लिए एक तरह से stopcocks पर STLV पेंच का शिकंजा कस.
- ओपन है knobs खड़ी स्थिति से पानी निकलने की टोंटी.
- 10 एमएल और 5 एमएल Luer ताला सिरिंज और फिर आस्तीन plungers रैपर में वापस बाँझपन बनाए रखने से plungers निकालें. भाड़ में stopcocks पर सीरिंज (Luer ताला टिप सीरिंज इस कदम के लिए आवश्यक हैं).
- Dulbecco है जोड़ें फॉस्फेट-buffered खारा (DPBS) 10 एमएल सिरिंज तक STLV पूर्ण है और 5 एमएल सिरिंज को भरने के लिए शुरू होता है.
- प्रत्येक सिरिंज में बाँझ plungers बदलें और सीरिंज की ड्राइविंग plungers बीच alternating द्वारा अवशिष्ट bioreactor में होने वाली बुलबुले को दूर.
- सभी बुलबुले को हटाने के बाद बायोरिएक्टर से जुड़ी सीरिंज छोड़ दें. बंद stopcocks और घूर्णन खड़ी मंच STLV देते हैं और 24 घंटे की एक न्यूनतम करने के लिए लीक के लिए निगरानी के लिए बारी बारी से.
2. Microcarrier मोती की तैयारी
- ~ 250 मिलीग्राम cytodex microcarrier 50 एमएल चोटीदार ट्यूब और आटोक्लेव में मोती के लिए STLV (1.4) के रूप में एक ही शर्तों के तहत 15 एमएल DPBS के जोड़ें.
- ठंडा करने के बाद, DPBS निकालने के लिए, मीडिया epitheli बढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जोड़नेब्याज की अल सेल, और ज़ुल्फ़ ट्यूब मोती resuspend.
- दो मीडिया और अधिक समय के साथ कदम को धोने के लिए दोहराएँ. अंतिम धोने के बाद मोतियों के लिए 15 एमएल विकास मीडिया को जोड़ने.
3. STLV bioreactor में उपकला कोशिकाओं और मोती के बीज बोने की क्रिया
- ऊतक संस्कृति बोतल में monolayers के रूप में ब्याज की उपकला कोशिकाओं को विकसित जब तक आप ≥ 1x10 7 कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए. कुप्पी (अर्थात् trypinsization, EDTA) से कोशिकाओं को हटाने, कोशिकाओं गिनती करने के लिए सेलुलर एकाग्रता स्थापित, और trypan नीले बहिष्कार 1 धुंधला द्वारा सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण.
- चोटीदार ट्यूब तैयार मोती (2.3 देखें) से युक्त करने के लिए, अपने आशय की उपकला कोशिका प्रकार (चित्रा 1 ए) पर निर्भर करता है कोशिकाओं की वांछित एकाग्रता (2x10 5 - 1x10 7 उपकला कोशिकाओं) 2, 8, जोड़ने. सभी कोशिकाओं चोटीदार ट्यूब rinsing के द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- STLV से DPBS और सीरिंज निकालें.
- केंद्र पोर्ट से प्लग निकालें और उपकला ग जोड़ेंपक्ष / STLV में मनका निलंबन के 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग. चोटीदार ट्यूब कुल्ला सुनिश्चित करने के सभी कोशिकाओं मोती / STLV करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और केंद्र पोर्ट प्लग की जगह.
- एक 5 और 10 एमएल रैपर में वापस सीरिंज और फिर आस्तीन plungers से plungers निकालें बाँझपन बनाए रखने के लिए. खुला stopcocks साथ बंदरगाहों में सीरिंज भाड़ में. मीडिया के साथ STLV भरें, plungers, और करीब stopcocks की जगह.
- कोई रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नव वरीयता प्राप्त STLV रखें.
- ओपन stopcocks, plungers का उपयोग बुलबुले को हटाने, और फिर करीब stopcocks.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 20 आरपीएम (चित्रा 1 बी) में humidified इनक्यूबेटर घूर्णन में STLV रखें. संस्कृतियों लगातार घुमाया जाना चाहिए जब नमूने, बदल रहा है, मीडिया, या कटाई समुच्चय (अगले अनुभाग देखें) के लिए 24 हेक्टेयर दिन को छोड़कर.
4. संवर्धन, नमूनाकरण, फोटो और संस्कृति की प्रलेखन
- द्वि में एक प्रारंभिक 96-120 संवर्धन कोशिकाओं के घंटे के बादoreactor, झुकाव STLV और कोशिकाओं मोती / व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है के द्वारा परिवर्तन मीडिया. सीरिंज निकालें, दोनों stopcocks खोलने के लिए, और बंद ~ पक्ष बंदरगाह (चित्रा 1C) से मीडिया के 75% डालना. मीडिया के सेलुलर चयापचय के आधार पर, या प्रारंभिक बोने और 96-120 घंटे संस्कृति अवधि के बाद हर दिन हर दूसरे दिन मीडिया बदल जाते हैं.
- 5 और plungers की 10 एमएल सीरिंज शून्य है पर पेंच और refeeding प्रोटोकॉल के रूप में ऊपर वर्णित (1.7-1.11) का पालन करें, तो पेंच जगह में मंच घूर्णन पर STLV वापस बंद कर दिया.
- ध्यान केंद्र बंदरगाह से दो 1.5 एमएल ट्यूबों में समुच्चय (~ 200 μL) की एक छोटी राशि निकालने द्वारा STLV में बोने के बाद हर 5-7 दिनों मॉनिटर और समुच्चय के विकास व्यवहार्यता. कुल कर्तन से बचने के लिए, सब कुल हस्तांतरण के लिए एक 1000 μL विंदुक टिप है कि बिंदु से किया गया है ~ 2 सेमी में कटौती और निष्फल का उपयोग.
- बदलें केंद्र प्लग, नए सीरिंज के साथ विनिमय, जैसा ऊपर वर्णित है STLV (1.7-1.11) ताजा मीडिया जोड़ने के लिए, और में STLV वापस जगहरोटेशन के साथ इनक्यूबेटर (3.8 देखें).
- सेलुलर व्यवहार्यता की निगरानी के लिए, एक दो 1.5 एमएल ट्यूब 4.3 चरण में aliquoted समुच्चय का उपयोग करने के लिए, और एक ही तरीके से मोती उपकला कोशिकाओं ऊतक संस्कृति बोतल (यानी trypsinization) से हटा रहे हैं से कोशिकाओं को हटाने. Trypan नीले धुंधला बहिष्कार 1 मॉनिटर व्यवहार्यता.
- इमेजिंग सेलुलर समुच्चय के लिए, 2 1.5 एमएल कुल अशेष भाजक है और एक कट ऑफ 1000 μL विंदुक टिप का उपयोग कर एक छोटा सा पेट्री डिश को हस्तांतरण करने के लिए मीडिया की 0.5-1 एमएल जोड़ें. छवि एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग समुच्चय (चित्रा -1).
5. स्थानांतरण और फसल काटने वाले समुच्चय
- कुछ उपकला कोशिका मॉडलों के लिए यह आवश्यक है एक डिस्पोजेबल हार्व संस्कृति 2 वातन वृद्धि करने के लिए समुच्चय हस्तांतरण. लगभग एक विश्लेषण के लिए समुच्चय कटाई करने से पहले सप्ताह, STLV से सीरिंज और stopcocks को हटाने और बंद ~ पक्ष बंदरगाह से मीडिया का 50% डालना.
- रेमove के है STLV केंद्र प्लग और ध्यान से केंद्रीय बंदरगाह (चित्र 1E) से 50 एमएल चोटीदार ट्यूब में सभी सामग्री डाल. के 5 एमएल मीडिया के साथ STLV दो बार कुल्ला और समुच्चय के बाकी के साथ गठबंधन कुल्ला.
- समुच्चय स्थानांतरित 5.2 में वर्णित के रूप में के साथ जारी रखें, लेकिन 50 एमएल चोटीदार ट्यूब से हार्व हस्तांतरण समुच्चय है.
- ध्यान हार्व से ~ 1 सप्ताह के बाद या STLV से फसल समुच्चय के रूप में (सेल प्रकार के आधार पर) ऊपर (5.2) प्रदर्शन किया था. संभावित परख प्रारूपों, assays कुल फसल के बाद और विश्लेषण के लिए नीचे देखें.
6. संभावित विश्लेषण अनुप्रयोगों, और Assays समुच्चय के साथ आयोजित
- विभिन्न प्रयोगात्मक प्रारूपों के लिए बीज बोने की क्रिया समुच्चय. 50 एमएल चोटीदार ट्यूब से एक 1.5 एमएल ट्यूब, 24 अच्छी तरह से थाली, या 96 में अच्छी तरह से थाली एक निष्फल कटौती बंद 1000 μL विंदुक टिप (चित्रा 1F) का उपयोग करने के लिए समुच्चय के वांछित राशि स्थानांतरण.
- धोने और preparविश्लेषण के लिए समुच्चय हैं. बाद समुच्चय तय हो चुका है मीडिया निकालें. DPBS सीधे ट्यूब के केंद्र के लिए या अच्छी तरह से बांटना तो सब समुच्चय हड़कंप मच जाता है. एक बार जब समुच्चय नीचे बसे है, DPBS हटाने और कई बार के रूप में की जरूरत के रूप में दोहराएँ.
- परोक्ष प्रयोग और विश्लेषण के लिए शिपिंग के समुच्चय. एक 50 एमएल ट्यूब के समुच्चय के वांछित राशि जोड़ें और 6.2 में के रूप में समुच्चय धोने. पूरी तरह से मीडिया, टोपी, और parafilm के साथ टोपी के आसपास 50 एमएल ट्यूब के रिसाव से बचने को भरने. सुरक्षित रूप से इच्छित स्थान करने के लिए समुच्चय रातोंरात जहाज परिवेश के तापमान पर.
- इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फिक्सिंग समुच्चय (चित्रा 2). स्कैनिंग संचरण, या इम्युनो - इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक 1.5 एमएल ट्यूब 150-300 μL समुच्चय के हस्तांतरण और समुच्चय DPBS (6.2) के साथ 3 बार धोने के द्वारा आयोजित किया जा सकता है. वांछित ऊष्मायन अवधि के लिए आवेदन विशेष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM, मंदिर, इम्युनो - EM, आदि) लगानेवाला 200 μL जोड़ें. निकालें ठीक करने के लिए, aggregat धोनातों DPBS साथ 2 बार, और आगे बढ़ने के रूप में Hjelm एट अल में स्कैनिंग और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 2 के लिए 2010 उल्लिखित.
- Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी इमेजिंग (चित्रा 3). स्थानांतरण ~ 1.5 एमएल ट्यूब और धोने समुच्चय (6.2) के लिए 100 μL समुच्चय. फिक्स और एंटीबॉडी के साथ लेबल समुच्चय monolayers साथ के रूप में इसी तरह की शर्तों के तहत एक 1.5 एमएल ट्यूब में छोड़कर. माउंट करने के लिए, खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ते मीडिया में से 1 बूंद जगह है, एक कट ऑफ 1000 μL पिपेट टिप, समुच्चय पर जगह coverslip, नेल पॉलिश के साथ सील coverslip, और सूखी रातोंरात स्लाइड 2 के साथ बढ़ते मीडिया के शीर्ष पर लेबल समुच्चय हस्तांतरण.
- सेलुलर व्यवहार्यता / MTT परख (चित्रा 4) का उपयोग प्रसार माप एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण समुच्चय. 625 μL phenol के लाल स्वतंत्र मीडिया के साथ मीडिया की जगह है और. एक अच्छी तरह से 5 मिलीग्राम / एमएल Thiazolyl है ब्लू Tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) की 62.5 μL जोड़ें और 37 में 4 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस 100 मिलीग्राम / एसडीएस 0.01 एमएल 625 μL जोड़ेंएम एचसीएल और एक अच्छी तरह से रातोंरात सेते हैं. 570 एनएम पर absorbance के पढ़ें और% सेल समीकरण का उपयोग कर व्यवहार्यता प्राप्त:
- विष विज्ञान के अध्ययन. 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए समुच्चय स्थानांतरण और trypan प्रारंभिक सेल व्यवहार्यता / एकाग्रता के लिए ≥ दो कुओं पर नीले बहिष्कार करते हैं. सांद्रता लेकर कुओं नकली परीक्षण यौगिक जोड़ें. सेल व्यवहार्यता के लिए (चित्रा 5A), समुच्चय धोने और उपचार के बाद trypan नीले बहिष्कार प्रदर्शन. (चित्रा 5 ब) 50 टीसी के लिए, समय के साथ प्रत्येक एकाग्रता के लिए डुप्लिकेट कुओं सेलुलर व्यवहार्यता और रीड MUENCH विधि का उपयोग करने के लिए विषाक्त एकाग्रता 50% 2, 15 निर्धारित है.
- Cytometric मनका (CBA) सरणी या एलिसा. सेलुलर supernatants किसी भी प्रयोगात्मक diagrammed प्रारूप में कोशिकाओं को बोने के बाद लिया जा सकता है. वरीय समुच्चय के रूप में उत्तेजित के साथ कोशिकाओं बड़े हो के रूप मेंmonolayers, -80 ° C (≥ 120 μL) में एलिसा या CBA (चित्रा 6) के द्वारा विश्लेषण के लिए supernatants, और दुकान इकट्ठा.
- शाही सेना विश्लेषण 1.5 एमएल ट्यूब और DPBS साथ धोने समुच्चय ≥ 500 μL समुच्चय के स्थानांतरण. निष्कर्षण जारी रखें जानवर की कोशिकाओं के लिए 20 गेज सुई का उपयोग lysate के homogenization के साथ क्विएज़न RNAeasy किट और प्रोटोकॉल का उपयोग कर. मोती ट्यूब के नीचे बसा है, सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरित करने से पहले, और स्पिन स्तंभ (मोती स्तंभ शाही सेना के कम उपज में जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली रोकना होगा) (चित्रा 7) करने के लिए स्थानांतरण नहीं खाली मोती करने के लिए सुनिश्चित करें.
- प्रोटीन विश्लेषण. एक 1.5 एमएल ट्यूब या बड़ा प्रयोगात्मक प्रारूप का उपयोग monolayers के साथ के रूप में एक ही तरीके के तहत फसल समुच्चय. हालांकि, समुच्चय के lysis के बाद, मोती और बसने के लिए एक प्रोटीन जेल या प्रोटीन विश्लेषण के अन्य प्रपत्र (8 चित्रा) चलाने से पहले lysate हस्तांतरण एक अलग ट्यूब के लिए अनुमति देते हैं.
- संक्रमणअध्ययन वांछित प्रायोगिक स्वरूप में बीज समुच्चय है. मोती से कोशिकाओं trypsinizing सेल नंबर और सेल व्यवहार्यता यों को एन्यूमरेट करने के लिए कम से कम दो कुओं / नमूने का उपयोग करें. संक्रमण के चयनित बहुलता पर ब्याज की रोगज़नक़ साथ समुच्चय को संक्रमित monolayers (चित्रा 9) के रूप में विकसित कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन के रूप में. 6.2 में धो कदम के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- प्रवाह cytometry: 50 एमएल ट्यूब, धोने समुच्चय (6.2), और 2mm EDTA के 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में बीज समुच्चय कोशिकाओं को 5-10 एमएल मीडिया जोड़ें और एक सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजारें. अशेष भाजक 1x10 6 ठंड अवरुद्ध समाधान में एक polypropylene ट्यूब और धोने की कोशिकाओं में कोशिकाओं (1% पीबीएस में FBS). एंटीबॉडी और निर्माता के अनुसार सेते हैं के साथ कोशिकाओं Resuspend. विश्लेषण (10 चित्रा) के लिए ट्यूब फ़िल्टर धो centrifugation द्वारा कोशिकाओं, पीबीएस में resuspend है है, और हस्तांतरण कोशिकाओं.
7. प्रतिनिधि परिणाम
का एक उदाहरणएक विभेदित मानव उपकला STLV बायोरिएक्टर प्रणाली में बड़े कुल चित्रा 2 में देखा जा सकता है. SEM और मंदिर छवियों मानव योनि 39 दिनों के लिए STLV में विकसित कोशिकाओं, जहां microridges, invaginations, intracellular स्रावी vesicles, और शिखर सतह पर microvilli मनाया जा सकता है से एकत्र कर रहे हैं. उपकला bioreactor में विकसित कोशिकाओं के vivo की तरह विशेषताओं के आगे प्रदर्शन 3 - डी योनि कोशिकाओं की immunofluorescence confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) छवियों mucin (MUC1) व्यक्त और उपकला कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्करों (ईएसए) और टर्मिनल भेदभाव के द्वारा देखा जा सकता है (Involucrin, INV).
के रूप में दिखाया गया है, 3 डी समुच्चय ultrastructural ऊतकों को समान सुविधाएँ प्रदर्शित करते हैं, लेकिन उनके और physiologically प्रासंगिक phenotypes भी यौगिकों की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट मंच के रूप में सेवा करते हैं. MTT परख, एक आमतौर पर इस्तेमाल के लिए सेल व्यवहार्यता, चयापचय या प्रसार को मापने परखtion, विभिन्न रसायनों और यौगिकों (चित्रा 4) के लिए विषाक्तता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ट्राइटन X-100, डिटर्जेंट है कि सेलुलर झिल्लियाँ को नष्ट कर देता है, MTT परख मान्य करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. परीक्षण यौगिकों के साथ इलाज के बाद विषाक्तता को मापने के लिए एक अतिरिक्त विधि trypan नीला अपवर्जन (चित्रा 5) है. उपचार के बाद nonoxynol 9 (9 एन) के साथ, योनि समुच्चय एक विषाक्तता गर्भाशय ग्रीवा के explant मॉडल के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया, लेकिन एक अलग प्रोफ़ाइल 2 monolayers, 16 की तुलना में.
अतिरिक्त अध्ययन है कि उपकला कोशिकाओं की क्षमता, bioreactor में हो, कार्य और vivo में ऊतकों को इसी तरह का संकेत प्रदर्शित, चित्रा 6 में मनाया जा सकता है. रोगाणुओं कि टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLR) द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं से व्युत्पन्न अणुओं के साथ उत्तेजना पर, समुच्चय जवाब और 1 आईएल -6 सहित समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, छिपाना.प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर), एक रिसेप्टर है कि हार्मोन उत्तेजना का जवाब है, की अभिव्यक्ति भी शाही सेना और प्रोटीन का स्तर (7 चित्रा और चित्र 8, क्रमशः) पर दोनों योनि कोशिकाओं में मनाया जा सकता है. 3 - डी समुच्चय रोगज़नक़ और हार्मोन अणुओं का जवाब करने की क्षमता ही नहीं है, लेकिन यह भी कार्यात्मक समर्थन एक दाद वायरस टाइप 2 (एचएसवी -2) संक्रमण सरल करने में सक्षम हैं. एचएसवी -2 से संक्रमित 3 - डी योनि समुच्चय (9 चित्रा) की एक confocal माइक्रोस्कोपी छवि संक्रमण को दर्शाता है. समानांतर 2 - डी योनि उपकला कोशिका संस्कृतियों एचएसवी -2 संक्रमण से गंभीर सेलुलर कारण विनाश के एक परिणाम के रूप में नहीं दिखाया जाता है. RWV व्युत्पन्न 3 डी समुच्चय भी intracellular विकास घटता और पट्टिका assays के माध्यम से बैक्टीरियल और वायरल प्रतिकृति यों, क्रमश: 8, 9 के लिए इस्तेमाल किया गया है. अन्त, समुच्चय भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के शारीरिक और कार्यात्मक गुण भी प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. Examp के लिएले, हम एक प्रवाह cytometry परख MUC1 व्यक्ति योनि कोशिकाओं (10 चित्रा) पर सतह अभिव्यक्ति को मापने कार्यरत हैं. योनि 3 - डी समुच्चय monolayers (67.2%) की तुलना में MUC1 की एक कम प्रतिशत (27.7%) व्यक्त की है. 3 - डी समुच्चय सतह पर कम MUC1 की monolayers की तुलना प्रतिशत MUC1 के बहुमत कोशिकाओं से secreted किया जा रहा है कि योनि पथ 17, 18 में मनाया के रूप में एक परिणाम हो सकता है.
आकृति 1. संवर्धन RWV में मानव उपकला कोशिकाओं और संभावित अनुप्रयोगों RWV व्युत्पन्न समुच्चय का उपयोग करने के लिए योजनाबद्ध.) उपकला कोशिकाओं शुरू में एक ऊतक संस्कृति फ्लास्क में monolayers के रूप में बड़े हो रहे हैं. एक बार मिला हुआ, कोशिकाओं कुप्पी से हटा रहे हैं और bioreactor STLV में microcarrier मोतियों के साथ संयुक्त. स्केल पट्टी: माइक्रोन 80) बी STLV कम च के लिए एक निरंतर मुक्त गिरावट माहौल बनाने के लिए एक मंच पर घूमता हैluid कतरनी, कोशिकाओं को देते हैं और इस तरह दिखाई सेलुलर सी. समुच्चय के गठन मोतियों पर) बढ़ने के 96 घंटे के बाद, STLV में मीडिया की अनुमति सेलुलर चयापचय के लिए समायोजित करने के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए. मीडिया के एक तरफ बंदरगाह के बाहर डाल दिया है, ताजा मीडिया एक संलग्न 10 एमएल सिरिंज (सवार हटा) के माध्यम से बदल दिया है, और सिरिंज plungers प्रतिस्थापित कर रहे हैं और बाहर निकालना बुलबुले के लिए इस्तेमाल किया डी) ~ 5 दिनों के बाद (घ) समुच्चय के लिए फार्म शुरू . समुच्चय हर 7 दिनों नमूना है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged उनके विकास की प्रगति (3 - डी मानव उपकला कोशिकाओं योनि 20x बढ़ाई) ई.) की निगरानी एक बार पूरी तरह कुल गठन और सेलुलर भेदभाव हुआ है, समुच्चय बायोरिएक्टर से harvested रहे हैं और pote की रूपरेखा एक 50 एमएल चोटीदार ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया. एफ) समुच्चय एक 1.5 एमएल ट्यूब या बहु - अच्छी तरह से एक थाली प्रयोगात्मक विश्लेषण और assays के बाहर ले जाने के प्रारूप में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है जी.) ntial assays और विश्लेषण है कि समुच्चय पर आयोजित किया जा सकता है. विश्लेषण के इस प्रतिनिधि सूची के लिए सभी संभावित बहाव के अनुप्रयोगों के एक संपूर्ण सूची का मतलब नहीं है.
चित्रा 2. 3 - डी उपकला कोशिका इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग समुच्चय के morphological और संरचनात्मक विशेषताओं की जांच (ए) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक 3-D मानव उपकला योनि सेल कुल की छवि. स्केल सलाखों: 200 (100x) माइक्रोन 100 माइक्रोन (200x), 50 माइक्रोन (500x). प्रसारण एक 3 डी मानव उपकला तीर (बी) के intracellular स्रावी vesicles और microvilli या (सी) "cytoplasmic प्रक्रियाओं की ओर इशारा करते के साथ योनि सेल कुल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि (मंदिर). स्केल सलाखों: 2 (Hjelm एट अल, 2010 से संशोधित) माइक्रोन 2.
/ g3.jpg ">
चित्रा 3. Confocal immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए 3 - डी उपकला कोशिका समुच्चय में junctional भेदभाव और प्रोटीन मार्कर की पहचान इस्तेमाल मानव 3 - डी योनि कोशिकाओं को 32 दिनों के बाद बायोरिएक्टर से काटा, निश्चित है, और (ए) mucin MUC1 एंटीबॉडी के साथ दाग, (बी) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी. उपकला कोशिकाओं, ईएसए, या (सी) विरोधी Involucrin (INV) एंटीबॉडी कि टर्मिनली विभेदित उपकला कोशिकाओं को पहचानता है. समुच्चय परोक्ष रूप से एलेक्सा 488 माध्यमिक एंटीबॉडी (हरा) के साथ लेबल रहे थे. पैमाने पर पट्टी: 60 (Hjelm एट अल, 2010 से संशोधित) माइक्रोन 2.
चित्रा 4. MTT परख सेलुलर व्यवहार्यता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है मानव 3 - डी योनि समुच्चय थे एक 24 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त और 37 पर मीडिया (इलाज) अकेले या 0.01%, 0.1% या 1.0% 1 ज के लिए ट्राइटन X-100 डिटर्जेंट के साथ इलाज ° सी. Followin छ उपचार मीडिया, हटा दिया गया था और MTT परख सेलुलर व्यवहार्यता को मापने के लिए किया गया था. ** 0.001 <पी का प्रतिनिधित्व करता है, एक पूंछ छात्र के टी - परीक्षण अनुपचारित नियंत्रण ट्राइटन एक्स-100 इलाज किया कोशिकाओं की तुलना.
चित्रा 5. स्क्रीन परिसर विषाक्तता के लिए 3 डी उपकला कोशिका समुच्चय उपयोग (ए) Nonoxynol-9 (9 एन) खुराक निर्भर व्यवहार्यता वक्र के 24 घंटे के बाद 3 डी मानव योनि उपकला कोशिका मॉडल (लाल रेखा / सलाखों) के उपचार की तुलना में. एक ही सेल प्रकार मिला हुआ monolayers (काला लाइन / सलाखों) के रूप में हो. (बी) N-9 टीसी (ए) में 1.5 ज, 4 घंटे, 8 घंटे, और 24 घंटे इलाज के बाद में 50 के स्तर योनि उपकला सेल संस्कृतियों. * 0.05 <पी का प्रतिनिधित्व करता है, एक पूंछ विद्यार्थी t-परीक्षण प्रत्येक जोखिम समय में 3 - डी कोशिकाओं को monolayers तुलना. (Hjelm एट अल, 2010 से संशोधित) 2.
Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg / "/>
6 चित्रा. टोल की तरह (TLR) रिसेप्टर agonist उत्तेजना के जवाब में 3 - डी उपकला कोशिकाओं में cytokine उत्पादन की तीन डी विश्लेषण मानव योनि कोशिकाओं. FSL (TLR2 / 6) के 1, तस्वीर (TLR3), झंडा (TLR5) के साथ प्रेरित किया गया , और 24 घंटे और secreted साइटोकिन्स के लिए (8 / TLR7) CL097 cytometric मनका सरणी के द्वारा मापा गया. आईएल -6 एक प्रतिनिधि proinflammatory cytokine उत्पादन और मापा के रूप में दिखाया गया है. * 0.05 <पी का प्रतिनिधित्व करता है, एक पूंछ छात्र के टी - परीक्षण से पीबीएस समूह के लिए प्रेरित नमूनों की तुलना. (Hjelm एट अल, 2010 से संशोधित) 2.
7 चित्रा. निगरानी 3 - डी उपकला कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति अर्द्ध मात्रात्मक RT-पीसीआर प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर) monolayer में अभिव्यक्ति (माले) या 3 - डी मानव योनि उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण. GAPDH एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है. प्रवर्धन उत्पादोंदिखाया प्रतिलेख 30 पीसीआर चक्र के बाद होने वाली अभिव्यक्ति का एक परिणाम के तीर हैं. पीआर केवल 3 - डी नमूना में होने वाली बैंड इंगित सिर.
संख्या 8. प्रोटीन 3 डी उपकला कोशिकाओं की अभिव्यक्ति विश्लेषण monolayer और 3 - डी मानव योनि उपकला कोशिका पूरे सेल lysates (30μg) की पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. एक विरोधी प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर) एंटीबॉडी के साथ जांच. β-ट्यूबिलिन नियंत्रण लोड करने के लिए एक जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
9 चित्रा. थ्री - डी मानव उपकला कोशिका मॉडल एक उत्पादक वायरल संक्रमण 3 डी मानव योनि उपकला कोशिका एचएसवी -2 से संक्रमित कुल की immunofluorescence Confocal माइक्रोस्कोपी छवि का समर्थन करता है. कोशिकाओं दो घंटे, धोया, निर्धारित 24 घंटे के बाद संक्रमण (4% पीएफए) के लिए 1.0 के MOI में संक्रमित थे और एक एचएसवी 2 विशिष्ट VP5 ग के साथ दागapsid प्रतिरक्षी (हरा) और परमाणु दाग DAPI (नीला). पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन.
10 चित्रा. 3 - डी मानव प्रवाह cytometry से उपकला कोशिका मॉडल में व्यक्तिगत सेल विश्लेषण. (ए) monolayer या (बी) 3 डी मानव योनि उपकला समुच्चय EDTA के साथ अलग थे, FITC संयुग्मित MUC1 प्रतिरक्षी (नीला), एक निर्धारण नियंत्रण (हरा), या पीबीएस (लाल) के साथ लेबल, और FITC अभिव्यक्ति के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था प्रवाह cytometry. संख्याएँ कि mucin प्रतिरक्षी कि निर्धारण नियंत्रण दाग कोशिकाओं से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बाहर gating के बाद बने रहे के लिए सकारात्मक दाग कोशिकाओं का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. गैर वर्दी चोटियों glycosolation और इन कोशिकाओं की सतह पर पैटर्न MUC1 की अलग - अलग स्तर की भीड़ का एक परिणाम के हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RWV bioreactor यहाँ प्रस्तुत प्रौद्योगिकी के उपयोग की क्षमता के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए एक और अधिक प्रासंगिक physiologically organotypic सेल संस्कृति मॉडल के लिए अपने मौजूदा सेल संस्कृति प्रणाली अग्रिम कर सकते हैं. RWV bioreactor सेल संस्कृति प्रणाली एक कम कतरनी microenvironment कि कोशिकाओं को तंग जंक्शनों, mucin उत्पादन, बाह्य प्रक्रियाओं (यानी microvilli), और सेलुलर polarity सहित vivo में की तरह विशेषताओं में से 3 - डी सेलुलर समुच्चय के रूप में सक्षम बनाता है प्रदान करता है. डेटा और उदाहरण यहाँ प्रस्तुत की बहुमत योनि उपकला RWV प्रणाली में विकसित कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, लेकिन RWV प्रणाली भी संस्कृति छोटी और बड़ी आंत, फेफड़े, मूत्राशय, यकृत, और tonsil उपकला कोशिकाओं सहित अन्य उपकला कोशिका प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया गया है 3 - डी organotypic एक मॉडल, 7-13, 18 के रूप में. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली संस्कृति सेल उपकला कोशिकाओं की तुलना में अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया है, और वर्तमान में विकास की जटिल, multicellular organotypic संस्कृति मॉडल 2 चल, 18.
प्रोटोकॉल यहाँ रेखांकित कर रहे हैं के लिए एक गाइड के रूप में सेवा करने का मतलब है, और ब्याज की सेल प्रकार के आधार पर संशोधित किया जा आवश्यकता हो सकती है. RWV प्रणाली में संवर्धन उपकला कोशिकाओं के लिए सबसे आम प्रोटोकॉल के लिए संशोधन, कोशिकाओं STLV में संवर्धित कर रहे हैं समय की लंबाई निर्णय और कुल STLV से हार्व हस्तांतरण के समय, और प्रारंभिक के लिए सेल / मनका अनुपात STLV में बीज बोने की क्रिया. एक और अधिक विशेष संशोधन है कि सफल कुल गठन के लिए विचार किया जा सकता है microcarrier मनका या पाड़ की सतह क्षेत्र, व्यास, आकार, सतह कोटिंग्स, घनत्व, प्रभारी, मुख्य सामग्री, और porosity के रूप में, गुण हैं. इसके अलावा, आधार संस्कृति मध्यम, निर्माण, या पूरक के लिए समायोजन, संस्कृति स्थिति अनुकूलन और समग्र गठन को अधिकतम आवश्यक हो सकता है. समायोजन भी बायोरिएक्टर प्रणाली और उसके घटकों के लिए किया जा सकता है में हो,बायोरिएक्टर पोत के आकार और घूर्णी गति समेत. Bioreactor भीतर microenvironment के एक बढ़ाया मूल्यांकन के लिए, एक perfused संस्कृति व्यवस्था भी उपलब्ध है जो संस्कृति पोत कुल गठन के लिए एक उर्वर वातावरण सुनिश्चित करने के भीतर पीएच, ऑक्सीजन, और ग्लूकोज का स्तर की सतत निगरानी के लिए अनुमति देता है. संभावित लंबा समय संस्कृति की स्थिति, कुल गठन, सेलुलर भेदभाव का अनुकूलन करने के लिए और प्रत्येक नए मॉडल प्रणाली, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बायोरिएक्टर प्रणाली की प्रारंभिक खर्च विशेषताएँ इस प्रणाली के लिए उल्लेखनीय कमियां हैं. हालांकि, किसी भी नई संस्कृति एक प्रयोगशाला में लागू प्रणाली के समान नुकसान होगा.
हम और दूसरों से पता चला है कि RWV व्युत्पन्न मानव कोशिकाओं का उपयोग मॉडल प्रभावकारिता, विषाक्तता, और टीके, माइक्रोबाइसाइडों, biologics के एक फैशन में है कि एक मनुष्य, 2, 18 के लिए प्रासंगिक है और दवाइयों की फार्माकोकाइनेटिक्स की भविष्यवाणी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है. वें की सफलता के साथबायोरिएक्टर संस्कृति प्रामाणिक मानव प्रतिक्रियाओं का उत्पादन प्रणाली, इसके लचीलेपन के साथ संयुक्त है, RWV bioreactor प्रणाली के अनुप्रयोगों वर्तमान में ट्यूमर मॉडलिंग, पुनर्योजी चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग 2, 18-23 के रूप में ऐसे क्षेत्रों के लिए विस्तारित किया जा रहा है. अग्रिम हमारे RWV जनित mucosal मॉडल के हम एक और अधिक जटिल multicellular प्रणाली है कि दोनों संरचना और मानव mucosal ऊतक के समारोह प्रतिकृति बनाने के लिए काम कर रहे हैं. हालांकि, लेखकों स्वीकार करते हैं कि यह करने के लिए उपयोग या कई मॉडल प्रणाली को एकीकृत करने के लिए जटिल सहभागिताओं है कि दवाओं या टीके मानव शारीरिक प्रणालियों के साथ पुन: पेश करने के लिए आवश्यक हो सकता है. कुल मिलाकर, RWV bioreactor और उसके प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों का उपयोग करने के हमारे लक्ष्य के लिए बेहतर mucosal ऊतक जीव विज्ञान और मानव organotypic मॉडल में पर्यावरण अपमान करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उसे तकनीकी विशेषज्ञता और एंड्रयू लार्सन के लिए अपने प्रोटीन विश्लेषण के ब्रुक Hjelm के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम के भाग में वैकल्पिक अनुसंधान विकास फाउंडेशन (MMHK) अनुदान और NIAID यौन संचारित संक्रमणों और सामयिक माइक्रोबाइसाइडों सहकारी अनुसंधान केंद्र IU19 AI062150 01 (MMHK) के NIH के द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम कृतज्ञता आंकड़े का पुन: उपयोग के लिए प्रजनन के जीवविज्ञान स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
