Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrkning og anvendelse af Roterende Wall Vessel bioreaktor Afledt 3D epitelcelletyper modeller

Published: April 3, 2012 doi: 10.3791/3868
Automatic Translation
1, 1
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

Summary

Et roterende cellekultur, der tillader epitelceller til at vokse under fysiologiske betingelser, hvilket resulterer i 3-D cellulær aggregatdannelse er beskrevet. Aggregaterne dannes display

Abstract

Celler og væv i kroppen oplevelse miljømæssige forhold, der påvirker deres arkitektur, intercellulære kommunikation, og overordnede funktioner. Til in vitro cellekulturmodeller nøjagtigt at efterligne vævet af interesse, vækstmiljø af kulturen er et kritisk aspekt at overveje. Almindeligt anvendte konventionelle cellekultursystemer udbreder epitelceller på flade todimensionale (2D) uigennemtrængelige overflader. Selvom vi har lært meget fra konventionelle celledyrkningssystemer, mange fund er ikke reproduceres i humane kliniske undersøgelser eller vævseksplantater, muligvis som følge af manglen på en fysiologisk relevant mikromiljø.

Her beskriver vi en kultur, der overvinder mange af de dyrkningsbetingelse grænser 2-D cellekulturer ved hjælp af den innovative roterende væg beholder (RWV) bioreaktor teknologi. Vi og andre har vist, at organotypiske RWV-afledte modeller kan gentage struktue, funktion og autentiske menneskelige reaktioner på eksterne stimuli på samme måde til mennesker eksplantation væv 1-6. Den RWV bioreaktor er en suspensionskultur, der tillader vækst af epitelceller under lav fysiologisk væske forskydningsbetingelser. Bioreaktorerne kommer i to forskellige formater, en høj-aspekt roterende beholder (HARV) eller en langsom drejning lateral beholder (STLV), hvor de afviger fra deres beluftning kilde. Epitelceller tilsættes til bioreaktoren valg i kombination med porøse, collagen-overtrukne mikrobærerperler (figur 1A). Cellerne udnytte perlerne som en vækst stillads under konstant frie fald i bioreaktoren (fig. 1B). Mikromiljøet fra bioreaktoren tillader cellerne at danne tredimensionale (3D) aggregater viser in vivo-lignende karakteristika ofte ikke observeret under standard 2-D dyrkningsbetingelser (figur 1D). Disse egenskaber omfatter stramme vejkryds, MUCos produktion apikale / basal orientering in vivo protein lokalisering, og yderligere epitelcelle-typespecifikke egenskaber.

Progressionen fra et monolag af epitelceller til en fuldt differentieret 3-D aggregat varierer baseret på celletype 1, 7-13. Periodisk prøveudtagning fra bioreaktoren tillader overvågning af epitel aggregatdannelse, cellulære differentieringsmarkører og levedygtighed (figur 1D). Gang cellulær differentiering og aggregatdannelse er etableret, høstes cellerne fra bioreaktoren, og lignende assays udført på 2-D-celler kan anvendes til de 3-D aggregater med nogle aspekter (fig. 1E-G). I dette arbejde beskriver vi detaljerede trin hvordan kultur 3-D epitelcelletyper aggregater i RWV bioreaktoren og en række potentielle assays og analyser, der kan udføres med de 3-D aggregater. Disse analyser indbefatter, men er ikke begrænset til, strukturelle / morphological analyse (konfokal, scanning og transmissions elektron mikroskopi), cytokin / chemokinet sekretion og cellesignalering (cytometrisk perle array og Western blot-analyse), genekspression analyse (real-time PCR), toksikologiske / narkotika analyse og vært-patogen interaktioner. Anvendelsen af ​​disse analyser lagt grunden til en mere dybdegående og omfattende undersøgelser, såsom metabolomics og transcriptomics, proteomics og andre array-baserede applikationer. Vores mål er at præsentere en ikke-konventionelle midler til dyrkning af humane epitelceller til at producere organotypiske 3-D modeller, der rekapitulerer den menneskelige in vivo væv, i en let og robust system, der skal bruges af forskere med forskellige videnskabelige interesser.

Protocol

Alle trin bør udføres under BSL-2-betingelser i et laminært stinkskab.

1. Forberedelse af STLV bioreaktor

  1. Samle STLV bioreaktoren ifølge producentens protokol og udføre afgiftning protokol til at sikre steriliteten af ​​bioreaktoren. Dæk åbne porte med luer-hætter og fyld STLV med 95% ethanol i 24 timer.
  2. Fjernelse af ethanol og fyld STLV med steriliseret destilleret vand i 24 timer.
  3. Gentag trin 1,2 med steriliseret destilleret vand.
  4. Med værktøjet leveret af leverandør, løsne alle skruer, kasketter og centrum stik fra STLV og autoklaveres ved 110 ° C i 20 min i en sterilisering pose.
  5. Når STLV afkøles, stramme skruerne, og gentag trin 1.1-1.4 for at sikre sterilitet og komplet afgiftning.
  6. Spænd skruer afkølet i STLV og skrue på præ-steriliserede one-way stophaner til hver port.
  7. Åbn stophanen ved at placere knapperne lodret.
  8. Fjerne stemplerne fra en 10 ml og 5 ml luer-lock sprøjte og re-T-stemplerne tilbage i indpakninger for at opretholde sterilitet. Skru sprøjter over på stophaner (Luer-Lock spids sprøjter kræves til dette trin).
  9. Tilsættes Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) til 10 ml sprøjte, indtil STLV er fuld, og begynder at fylde 5 ml sprøjte.
  10. Udskift sterile stemplerne i hver sprøjte og fjerne resterende bobler forekommer i bioreaktor ved at skifte mellem at køre stempler i sprøjterne.
  11. Forlade sprøjter forbundet med bioreaktoren efter fjernelse alle bobler. Luk stophaner og fastgøre STLV til den roterende lodret platform og rotere i mindst 24 timer til at overvåge for utætheder.

2. Forberedelse mikrobærekorn

  1. Der tilsættes 15 ml DPBS til ~ 250 mg Cytodex mikrobærekorn i en 50 ml konisk rør og autoklaven under samme betingelser som STLV (1,4).
  2. Efter afkøling fjernes DPBS tilsættes medier, der anvendes til at vokse epithelial celle af interesse, og vend røret for at resuspendere perlerne.
  3. Gentag vaske trin med medierne to gange mere. Efter den endelige vask tilsættes 15 ml vækstmedie til perler.

3. Seedning epitelceller og perler i STLV bioreaktor

  1. Vokser epitelcellerne af interesse som monolag i vævskulturkolber indtil opnåelse af ≥ 1x10 7-celler. Fjerne celler fra kolben (dvs. trypinsization, EDTA), tælle celler til at etablere cellulære koncentration, og bestemme cellulær levedygtighed ved trypanblå eksklusion farvning 1.
  2. Den koniske rør indeholdende tilberedte perler (se 2.3), ønskede koncentration af celler (2x10 5-1x10 7 epitelceller) 2, 8 tilsættes, afhængigt af epitelcelle type hensigt (figur 1A). Sørg for at alle celler overføres ved at skylle den koniske rør.
  3. Fjerne DPBS og sprøjter fra STLV.
  4. Fjern stikket fra centrum havnen og tilføje epithelial cell / perlesuspensionen i STLV anvendelse af 10 ml serologisk pipette. Skyl konisk røret for at sikre alle celler / perler overføres til STLV og erstatte centrum port stik.
  5. Fjern stemplerne fra et 5 og 10 ml sprøjter og re-sleeve stempler tilbage i indpakning for at opretholde sterilitet. Skru sprøjter i havne med åbne stophaner. Fyld STLV med medier, erstatte stemplerne, og nære stophaner.
  6. Anbring den nyligt podet STLV i en 37 ° C inkubator i 30 minutter uden rotation.
  7. Åbne stophaner, fjerne bobler med stemplerne, og luk derefter stophaner.
  8. Placere STLV i et 37 ° C, 5% CO 2 befugtet inkubator roterende ved 20 rpm (fig. 1B). Kulturer skal drejes kontinuerligt 24 ha dage undtagen når prøvetagning og skiftende medier eller høst aggregater (se næste afsnit).

4. Dyrkning, Sampling, og fotodokumentation af Cultures

  1. Efter en indledende 96-120 h dyrkning af celler i bioreactor, skifte medie ved at vippe den STLV og tillader celler / perler at bosætte sig. Fjerne sprøjter, åbne begge stophaner, og hæld ~ 75% af mediet fra sideport (figur 1C). Baseret på cellulære metabolisme medier, medier hver dag eller hver anden dag efter første såning og 96-120 h kultur periode ændre sig.
  2. Skru på 5 og 10 ml sprøjter tomrum af stemplerne og følg refeeding protokol som beskrevet ovenfor (1,7-1,11), og skru derefter lukkede STLV tilbage på plads på roterende platform.
  3. Overvåge vækst og levedygtighed af aggregater hver 5-7 dage efter podning i STLV ved omhyggeligt at fjerne en lille mængde af aggregater (~ 200 uL) fra centrum porten i to 1,5 ml rør. For at undgå aggregat forskydning for alle samlede overførsler anvende en 1000 uL pipettespids, der er blevet skåret ~ 2 cm fra det punkt og steriliseres.
  4. Udskift center stik, udveksling med nye sprøjter, tilføje nye medier til STLV som beskrevet ovenfor (1,7-1,11), og placer STLV tilbage iinkubator med rotation (se 3,8).
  5. Til overvågning cellulær levedygtighed, skal du bruge en af ​​de to 1,5 ml rør aggregater portionsopdelt i trin 4,3, og fjerne celler fra perler på samme måde skal de epitelceller er fjernet fra vævskulturkolber (dvs. trypsinbehandling). Overvåge levedygtighed ved trypanblå-eksklusion farvning 1.
  6. Til billeddannelse cellulære aggregater, tilsættes 0,5-1 ml af medier til den anden 1,5 ml aggregat portion og overføres til en lille petriskål ved anvendelse af en cut-off 1000 uL pipettespids. Billeddata aggregater med et inverteret lysmikroskop (figur 1D).

5. Overførsel og Høst Tilslagsmaterialer

  1. For visse epitelceller modeller er det nødvendigt at overføre aggregater en engangs HARV at forøge kultur beluftning 2. Omkring en uge før høst aggregater til analyse, fjerne sprøjter og stophaner fra STLV og hæld ~ 50% af medier fra side havnen.
  2. Remove det STLV centrum stik og omhyggeligt hæld hele indholdet i en 50 ml konisk rør fra central havn (Figur 1E). Skyl STLV to gange med 5 ml medier og kombinere skyl med resten af ​​aggregater.
  3. Fortsætter med at overføre aggregater som beskrevet i 5.2, men overførsel aggregater fra 50 ml konisk rør til HARV.
  4. Omhyggeligt høst aggregater fra HARV efter ~ 1 uge, eller fra STLV (baseret på celletype) som blev udført ovenfor (5.2). Se nedenfor for potentielle testformater, analyser og analyser efter den samlede høst.

6. Potentiel Analyse, Programmer og analyser udført med aggregater

  1. Podning aggregater for forskellige eksperimentelle formater. Overførsel ønskede mængde af aggregater af 50 ml konisk rør på en 1,5 ml rør, 24-brønds plade eller plade med 96 brønde under anvendelse af en steriliseret cut-off 1000 uL pipettespidsen (fig. 1F).
  2. Vask og preparING aggregater til analyse. Fjern medier efter aggregater har slået sig ned. Dispenser DPBS direkte til centrum af rør eller godt, så alle aggregater røres op. Når aggregater har slået sig ned til bunden, fjerne DPBS og gentag så mange gange som nødvendigt.
  3. Forsendelse aggregater for off-site eksperimenter og analyse. Tilsæt den ønskede mængde af aggregater til et 50 ml rør og vask aggregater, som i 6,2. Helt fylde 50 ml tube med medier, cap, og parafilm omkring hætten for at undgå lækage. Sikkert skib aggregater til det ønskede sted natten over ved omgivelsestemperatur.
  4. Fastsættelse aggregater til elektronmikroskopi (figur 2). Scanning, transmission eller immuno-elektronmikroskopi kan udføres ved at overføre 150-300 gl aggregater med en 1,5 ml rør og vask aggregater 3 gange med DPBS (6,2). Tilsæt 200 pi applikationsspecifik (SEM, TEM, immuno-EM, etc.) elektronmikroskopi fiksativ for den ønskede inkubationstid. Fjern løse, vask Aggregates 2 gange med DPBS, og fortsæt som beskrevet i Hjelm et al. 2010 for scanning og transmissions elektron mikroskopi 2.
  5. Immunfluorescensmikroskopi billeddannelse (figur 3). Overførsel ~ 100 uL aggregater til et 1,5 ml rør og vask aggregater (6,2). Fix og mærke aggregater med antistof under lignende vilkår som med monolag, undtagen i et 1,5 ml rør. For at montere, skal du placere 1 dråbe montering medier på objektglas, overføre mærkede aggregater på toppen af montering medier med en cut-off 1000 uL pipettespids, sted dækglasset over aggregater, sæl dækglas med neglelak, og tør slide natten 2.
  6. Måling af cellulær levedygtighed / proliferation under anvendelse af MTT-assayet (fig. 4). Overfør aggregater til en 24 brønds plade og erstatte medierne med 625 gl phenolrødt-frit medium. Tilsættes 62,5 pi af 5 mg / ml Thiazolyl blå tetrazoliumbromid (MTT) til hver brønd og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C. Tilsættes 625 pi 100 mg / ml SDS-,01M HCl til hver brønd og inkuber natten over. Absorbansen aflæses ved 570 nm og opnå% cellelevedygtighed ved anvendelse af ligning:

Ligning 1

  1. Toksikologiske undersøgelser. Overførsel aggregater til 24 brønds plade og udføre trypan blåt eksklusion ≥ 2 brønde for den indledende cellelevedygtighed / koncentration. Tilsættes testforbindelsen i området koncentrationer til duplikatbrønde. For cellelevedygtighed (fig. 5A), vask aggregater og udføre trypanblåt-udelukkelse efter behandling. For TC 50 (fig. 5B), at cellulær levedygtighed dobbelte brønde for hver koncentration over tid og anvendelse Reed Muench-metoden til bestemmelse toksisk koncentration 50% 2, 15.
  2. Cytometrisk vulst arrayet (CBA) eller ELISA. Cellular supernatanter kan tages efter såning celler i enhver eksperimentel afbildet format. Stimulere podede aggregater som med celler dyrket sommonolag, indsamle supernatanter (≥ 120 uL) og opbevares ved -80 ° C til analyse ved ELISA eller CBA (figur 6).
  3. RNA-analyse. Overføres ≥ 500 pi aggregater til 1,5 ml rør og vask aggregater med DPBS. Fortsæt ekstraktion med Qiagen RNAeasy kit og protokol til animalske celler med homogenisering af lysat bruge 20-gauge kanyle. Sørg for at lade perler sig på bunden af røret, før overførsel supernatant, og IKKE overføre tomme perler til spinkolonne (perler vil tilstoppe kolonne membranen resulterer i lav RNA udbytte) (figur 7).
  4. Proteinanalyse. Harvest aggregater under de samme metoder som i monolag ved anvendelse af en 1,5 mL rør eller større eksperimentel format. Men efter lysis af de aggregater, tillader kuglerne at bundfælde, og overføre lysat til en separat rør før kører et protein gel eller anden form for protein-analyse (figur 8).
  5. Infektionundersøgelser. Seed aggregater i den ønskede eksperimentel format. Brug mindst to brønde / prøver for trypsinizing celler fra perler at opregne celle nummer og kvantificere celle levedygtighed. Infect aggregater med patogenet af interesse på udvalgte multiplicitet af infektion, som udføres med celler dyrket som monolag (figur 9). Vasketrin skal udføres som i 6.2.
  6. Flowcytometri: frø aggregater i 50 ml rør, vask aggregater (6,2), og der tilsættes 2 mM EDTA i 5-10 minutter ved 37 ° C. Tilsættes 5-10 ml medier celler og passerer celler gennem en celle si. Alikvote 1x10 6 celler i et polypropylenrør og udvaskede celler i koldt blokerende opløsning (1% FBS i PBS). Resuspender celler med antistof og inkuberes i henhold til producentens. Vask cellerne ved centrifugering, resuspender i PBS, og overførsel celler til filterrøret til analyse (figur 10).

7. Repræsentative resultater

Et eksempel påen differentieret human epithelial aggregat dyrket i STLV bioreaktoren systemet kan ses i figur 2. SEM-og TEM billeder indsamles fra humane vaginale celler dyrket i STLV i 39 dage, hvor microridges og invaginationer, intracellulære sekretoriske vesikler og mikrovilli på den apikale overflade kan observeres. Yderligere demonstration af in vivo-lignende egenskaber epitelceller dyrket i bioreaktoren kan observeres ved konfokal immunfluorescensmikroskopi billeder (figur 3) 3-D vaginale celler, der udtrykker mucin (MUC1) og markører specifikke for epitelceller (ESA) og terminal differentiering (involucrin, INV).

Som vist, 3-D aggregater vise ultrastrukturelle lignende kendetegn væv, men deres mere fysiologisk relevante fænotyper også tjene som en glimrende platform for at vurdere toksicitet af forbindelser. MTT assayet er en almindeligt anvendt assay til måling af cellelevedygtighed, metabolisme eller proliferation, kan anvendes til at måle toksicitet for forskellige kemikalier og forbindelser (figur 4). Triton X-100, et detergent, der ødelægger cellulære membraner, blev anvendt som en positiv kontrol for validering af MTT-assayet. En yderligere fremgangsmåde til måling toksicitet efter behandling med testforbindelserne er trypanblåteksklusion (figur 5). Efter behandling med nonoxynol-9 (N-9), viste de vaginale aggregater en toksicitet reaktion svarende til den i cervikale eksplantation modeller, men en anderledes profil i forhold til monolag 2, 16.

Yderligere undersøgelser, der viser evnen af epitelceller, dyrket i bioreaktoren, kan fungere og signalere lignende til væv in vivo, kan observeres i figur 6. Ved stimulering med molekyler afledt fra mikrober, der genkendes af Toll-lignende receptorer (TLR), reagerer aggregaterne og secernere pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL-6 1.Ekspression af progesteronreceptoren (PR), en receptor, som reagerer på hormonstimulation, kan også observeres i de vaginale cellerne både RNA og protein-niveauer (figur 7 og figur 8, henholdsvis). De 3-D-aggregater ikke kun være i stand til at reagere på patogene og hormon-molekyler, men er også i stand til funktionelt at understøtte et herpes simplex-virus type 2 (HSV-2) infektion. En konfokal mikroskopi billede af HSV-2 inficerede 3-D vaginale aggregater (figur 9) viser infektion. Parallelle 2-D vaginale epitel cellekulturer ikke vist på grund af alvorlig cellulær ødelæggelse forårsaget af HSV-2 infektion. RWV-afledte 3-D aggregater er også blevet anvendt til at kvantificere bakteriel og viral replikation ved intracellulære vækstkurver og plaque-assays, henholdsvis 8, 9. Endelig kan de fysiske og funktionelle egenskaber af individuelle celler inden for aggregater også kvantificeres ved flowcytometri. For example, anvendte vi en flowcytometri assay til måling af MUC1 overflade-ekspression på individuelle vaginale celler (figur 10). Vaginale 3-D aggregater udtrykt en lavere procentdel af MUC1 (27,7%) sammenlignet med monolag (67,2%). Den lavere procentdel af MUC1 på 3-D aggregater overflade i forhold til monolag kan være et resultat af størstedelen af MUC1 blev secerneret fra cellerne, som observeres i vagina 17, 18.

Figur 1
Figur 1. Skematisk billede til dyrkning af humane epitelceller i RWV og potentielle anvendelser anvender RWV-afledte aggregater. A) epithelceller indledningsvis dyrkes som monolag i en vævsdyrkningskolbe. Når sammenflydende, celler fjernet fra kolben og kombineret med mikrobærerperler i STLV bioreaktoren. Målestok:. 80 um B) Den STLV roterer på en platform til at skabe en konstant frit fald miljø med lav fluid forskydning, tillader cellerne at fæstne og vokse på perler, hvorved der dannes synlige cellulære aggregater. C) Efter 96 timer, mediet i STLV skal ændres for at imødekomme for cellulær metabolisme. Mediet hældes ud af en sideport, der friske medier erstattes med en vedhæftet 10 ml sprøjte (stempel fjernet), og sprøjter stempler udskiftes og anvendes til at ekstrudere bobler. D) Efter ~ 5 dage (d) aggregaterne begynder at danne . Aggregaterne udtages hver 7. dag og afbildes ved lysmikroskopi for at overvåge deres udviklingsmæssige progression (20x forstørrelse af 3-D humane epitelceller vaginale celler). E) Når fuldstændig aggregatdannelse og cellulær differentiering er forekommet, er aggregater høstet fra bioreaktoren og overføres til en 50 ml konisk rør. F) aggregater kan podes i et 1,5 ml rør eller en multi-brønds pladeformat at udføre eksperimentel analyse og assays. G) Skitsering af pote ntial assays og analyser, som kan udføres på aggregaterne. Denne repræsentativ liste af analyser er ikke tænkt som en udtømmende katalog over alle potentielle downstream-anvendelser.

Figur 2
Figur 2. Behandlingen morfologiske og strukturelle karakteristika af 3-D epitelceller celleaggregater med elektronmikroskopi. (A) Scanningselektronmikroskopi (SEM) billede af en 3-D human epithelial vaginal celleaggregatudvikling. Målestoksforhold: 200 um (100x), 100 uM (200x), 50 um (500x). Transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder af en 3-D human epithelial vaginal celleaggregatudvikling med pile pegende i (B) intracellulære sekretoriske vesikler og mikrovilli eller (c) "cytoplasmiske processer". Målestoksforhold: 2 um (modificeret fra Hjelm et al 2010.) 2.

g3.jpg "/>
Figur 3. Konfokal immunfluorescensmikroskopi anvendes til at identificere forbindelsesepitop differentiering og proteinmarkører i 3-D epiteliale celleaggregater. Humane 3-D vaginale celler høstet fra bioreaktoren efter 32 dage, faste og farvet med (A) mucin antistof MUC1, (B) antistof specifikt for epitelceller, ESA eller (C) anti-involucrin (INV) antistof, der genkender terminalt differentierede epitelceller. Aggregaterne blev indirekte mærket med Alexa 488 sekundært antistof (grøn). Målestok: 60 um (modificeret fra Hjelm et al 2010.) 2.

Figur 4
Figur 4. MTT-assay anvendes til måling af cellulær levedygtighed. Humane 3-D vaginale aggregater blev podet i en 24 brønds plade og blev behandlet med medier alene (ubehandlet) eller 0,01%, 0,1% eller 1,0% Triton X-100 detergent i 1 time ved 37 ° C. Followin g behandling, blev mediet fjernet, og MTT-assayet blev udført til måling af cellulær levedygtighed. ** Betegner p <0,001, en-halet Student t-test sammenlignet Triton X-100 behandlede celler til ubehandlet kontrol.

Figur 5
Figur 5. Anvendelse af 3-D epitelceller celleaggregater at screene forbindelser toksicitet. (A) nonoxynol-9 (N-9) dosisafhængig levedygtighed kurve 24 timer efter behandling af 3-D human vaginal epitelcelle model (rød linje / søjler) i forhold til samme celletype dyrket som konfluerende monolag (sorte linie / søjler). (B) N-9 TC 50 niveauer af vaginale epitel cellekulturer i (A) ved 1,5 h, 4 h, 8 timer og 24 timer efter behandling. * Betegner p <0,05, en-halet Student t-test sammenlignet monolag til 3-D-celler ved hver eksponeringstid. (Modificeret fra Hjelm et al. 2010) 2.

/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
Figur 6. Analyse af cytokinproduktion i 3-D epitelceller som reaktion på toll-lignende receptor (TLR) agoniststimulering. Tre-D humane vaginale celler blev stimuleret med FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) og CL097 (TLR7 / 8) i 24 timer og secernerede cytokiner blev målt ved cytometriske vulst arrayet. IL-6 er vist som en repræsentativ proinflammatorisk cytokin, der produceres og måles. * Betegner p <0,05, en-halet Student t-test sammenlignet stimulerede prøver PBS-gruppen. (Modificeret fra Hjelm et al. 2010) 2.

Figur 7
Figur 7. Overvågning af genekspression i 3-D-epitelceller. Semi-kvantitative RT-PCR-analyse af progesteronreceptor (PR)-ekspression i monolag (ML) eller 3-D humane vaginale epitelceller. GAPDH er vist som en belastning kontrol. Amplifikationsproduktervist, er et resultat af udskrift udtryk opstår efter 30 PCR-cykler. Arrow hoveder peger på PR bands kun forekommer i 3-D-prøve.

Figur 8
Figur 8. Proteinekspression analyse af 3-D-epitelceller. Western blot-analyse af monolaget og 3-D humane vaginale epitelceller helcellelysater (30 ug) probet med et anti-progesteronreceptor (PR) antistof. β-tubulin blev anvendt som en probe til lastning kontrol.

Figur 9
Figur 9. Tre-D human epitelcelle model understøtter en produktiv virusinfektion. Konfokal immunfluorescensmikroskopi billede af 3-D human vaginal epitelcelle aggregat inficeret med HSV-2. Celler blev inficeret ved en MOI på 1,0 i to timer, vasket, fikseret 24 timer efter infektion (4% PFA) og farvet med en HSV-2 specifik VP5 capsid antistof (grøn) og nuklear farvning DAPI (blå). Målestok: 50 um.

Figur 10
Figur 10. Individuel celle-analyse i 3-D human epithelial cell model ved flowcytometri. (A) monolag eller (b) 3-D humane vaginale epitel aggregater blev dissocieret med EDTA, mærket med et FITC-konjugeret MUC1 antistof (blå), en isotypekontrol (grøn) eller PBS (rød) og FITC ekspression blev kvantificeret ved flowcytometri. Tal repræsenterer den procentdel af celler, der farves positive for mucin antistof, der er tilbage efter gating ud baggrundsfluorescens fra isotypekontrolantistoffer farvede celler. Ikke-ensartede toppe er et resultat af mange glycosolation mønstre og varierende niveauer af MUC1 på overfladen af ​​disse celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udnyttelse af RWV bioreaktorteknologi præsenteret her kan give forskere mulighed for at fremme deres nuværende cellekultursystem til en mere fysiologisk relevant organotypisk cellekultur model. Den RWV Bioreaktoren cellekultursystem tilvejebringer en lav forskydning mikromiljø, der muliggør celler til dannelse af 3-D cellulære aggregater med in vivo-lignende egenskaber, herunder tight junctions og mucinproduktion og ekstracellulære processer (dvs. mikrovilli) og cellulære polaritet. Størstedelen af ​​data og eksempler præsenteres her benytter vaginale epitelceller dyrket i RWV systemet imidlertid RWV systemet også blevet anvendt til dyrkning af andre epitelceller celletyper, herunder tynd-og tyktarmen, lunge, blære, lever og tonsil epitelceller til dannelse af 3-D organotypiske modeller 1, 7-13, 18. Derudover er dette system blevet anvendt til dyrkning andre celletyper end epitelceller, og i øjeblikket udvikling af komplekset, multicellular organotypisk kultur modeller er på vej 2, 18.

Protokollerne beskrevet her, er beregnet til at fungere som en vejledning, og kan være nødvendigt at ændre baseret på celletypen af ​​interesse. De mest almindelige modifikationer af protokollen til dyrkning epitelceller i RWV system omfatter tidsrum cellerne dyrkes i STLV, afgørelsen og timingen af ​​aggregat overførsel fra STLV til HARV, og celle / perle-forhold for den første podning i STLV. En mere specialiseret modifikation, som kan anses for vellykket aggregatdannelse er egenskaberne af mikrobærer vulsten eller skelet, såsom overfladeareal, diameter, form, overfladebelægninger, massefylde, ladning, kernemateriale, og porøsitet. Desuden kan justeringer af basen dyrkningsmediet formulering eller kosttilskud, være nødvendigt at optimere dyrkningsbetingelserne og maksimere aggregatdannelse. Justeringer kan også ske til bioreaktor systemet og dets komponenter, i; herunder de størrelsen af ​​bioreaktoren beholderen og rotationshastighed. For en bedre vurdering af mikromiljøet i bioreaktoren, er en perfuseret dyrkningssystem også tilgængelige, som muliggør kontinuerlig overvågning af pH, oxygen og glukose niveauer i dyrkningsbeholderen sikre en produktiv miljø for aggregatdannelse. Den potentielt længere tid at optimere dyrkningsbetingelser og aggregatdannelse, cellulær differentiering og karakterisere hver ny model system, såvel som den første bekostning af bioreaktoren system, er bemærkelsesværdige ulemper ved dette system. Dog vil enhver ny kultur implementeret i et laboratorium, har lignende ulemper.

Vi og andre har vist, at RWV-afledte modeller anvender humane celler kan være et værdifuldt værktøj til at forudsige effekten, giftighed og farmakokinetik af vacciner, mikrobicider, biologiske og farmaceutiske produkter på en måde, der er relevant for mennesker 1, 2, 18. Med den succes ther bioreaktor kultur-system til at producere autentiske menneskelige reaktioner, kombineret med sin fleksibilitet, er de anvendelser af RWV bioreaktor system i øjeblikket ved at blive udvidet til sådanne områder som tumor modellering, regenerativ medicin, og vævsmanipulering 2, 18-23. For at fremme vores RWV-genererede slimhinde modeller vi arbejder på at skabe en mere kompleks flercellet system, der gengiver både struktur og funktion af det menneskelige slimhindevævet. Forfatterne har imidlertid erkende, at det kan være nødvendigt at anvende eller integrere flere modelsystemer til at reproducere de komplekse vekselvirkninger, lægemidler eller vacciner har med humane fysiologiske systemer. Samlet set er vores mål at bruge RWV bioreaktor og dens eksperimentelle applikationer er bedre at kunne forstå slimhindevævet biologi og de cellulære reaktioner på miljømæssige skader i humane organotypiske modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Brooke Hjelm for hendes teknisk ekspertise og Andrew Larsen for sin protein analyse. Dette arbejde blev finansieret delvist af Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant og NIH NIAID seksuelt overførte infektioner og aktuelt mikrobicider Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi takker for Biology of Reproduction for genbrug af tal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21131 Used at 1:500 dilution
FACSDiva BD Biosciences Flow cytometer
β-tublin antibody Calbiochem 654162 Used at 1:5000 dilution
Bio-Plex 2000 Bio-Rad 171-000205 v5 software
Bioreactor and components Synthecon RCCS-4
Cell strainer BD Biosciences 352340 40μm pore size
Conical tube (50mL) Corning 5-538-60
Coverslips VWR international 48366067
Cytokine bead array kits Bio-Rad Custom human kit
Cytodex beads Sigma-Aldrich C3275
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
EDTA Sigma-Aldrich ED-500G Ethylenediaminetetraacetic acid
Epithelial specific antibody (ESA) Chemicon International CBL251 Used at 1:50 dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10438 Heat inactivated
HARV (Disposable) Synthecon D-405
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 37%
Involucrin antibody Sigma-Aldrich I 9018
Microscope slides VWR international 16004-368
MTT reagent MP Biomedicals 194592 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide
MUC1 antibody (microscopy) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-7313 Used at 1:50 dilution
MUC1 antibody (flow cytometry) BD Biosciences 559774 Also called CD227, use 20μL per test
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4% in DPBS
Petri dish (small) BD Biosciences 353002
Polystyrene tube with filter BD Biosciences 352235
Polystyrene flow tube BD Biosciences 352058
PR antibody Dako M3569 Used at 1:100 dilution
ProLong Gold Invitrogen P36931 Mounting media with DAPI
RNeasy Mini Kit Qiagen 74903
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71725
Sterilization pouch VWR international 11213-035
Stopcocks (one-way) MedexSupply MX5061L
Syringe (10mL) BD Biosciences 309604 Luer-lock tip
Syringe (5mL) BD Biosciences 309603 Luer-lock tip
Trypan Blue Invitrogen T10282
Vp5 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-13525 HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
  3. Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
  4. Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
  5. Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
  6. Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
  7. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  8. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
  9. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
  10. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
  11. Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
  12. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
  13. Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
  14. Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
  15. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  16. Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
  17. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
  18. Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
  19. Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
  20. Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
  21. Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
  22. Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
  23. Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
  24. Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).

Tags

Cellular Biology roterende væg beholderen bioreaktor kvindelige kønsveje humane epitelceller tredimensionale organotypiske mucosale modeller vaginale epitelceller mikrobicid herpes simplex virus toksikologi værtspatogene interaktioner hormonreceptorer
Dyrkning og anvendelse af Roterende Wall Vessel bioreaktor Afledt 3D epitelcelletyper modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M.… More

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. J. Vis. Exp. (62), e3868, doi:10.3791/3868 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter