Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado<sup> 18</sup> O-agua enriquecida (Leo-flujos de trabajo) son herramientas versátiles para estudios de proteómica cuantitativa y cualitativa. En los flujos de trabajo asistidas proteasa-(paleo),<sup> 18</sup> Átomos de O son introducidos por la escisión proteolítica y carboxilo reacciones de intercambio de oxígeno mediada por proteasas. En el catalizada por ácido (Aleo) flujo de trabajo,<sup> 18</sup> Átomos de O son introducidos por intercambio de oxígeno carboxilo a pH bajo.
Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masa biológica. Históricamente, 18 O-isótopos estables se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos catalíticos de enzimas proteolíticas 1-3. Con el advenimiento de la espectrometría de masas basado proteómica, la incorporación catalizada enzimáticamente de 18 átomos de O de agua estable enriquecido isotópicamente se ha convertido en un método popular para comparar cuantitativamente los niveles de expresión de proteína (revisado por Fenselau y Yao 4, Miyagi y Rao 5 y Ye et al. 6). 18 O-etiquetado constituye una alternativa simple y de bajo costo a los productos químicos (por ejemplo, iTRAQ, ICAT) y metabólicos (por ejemplo SILAC) técnicas de marcado 7. Dependiendo de la proteasa utilizada, 18 O-etiquetado puede dar lugar a la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en el grupo carboxilo C-terminal del producto de escisión 3 </sup>. La reacción de marcaje se puede subdividir en dos procesos independientes, la escisión del enlace peptídico y la reacción de oxígeno intercambio carboxilo 8. En nuestro Paleo (p rotease-a e l Abeling ssisted mploying 18 O agua enriquecida) la adaptación enzimática de 18 O-etiquetado, se utilizó 50% 18 O enriquecida con agua para producir firmas isotópicas distintivas. En combinación con la alta resolución de láser asistida por matriz de ionización de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas tándem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), los sobres de isótopos característicos se puede utilizar para identificar los productos de escisión con un alto nivel de especificidad. Anteriormente ha utilizado el paleo-metodología para detectar y caracterizar proteasas endógenas 9 y controlar las reacciones proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica la esencia misma de la reacción de escisión proteolítica, el montaje experimental es enri sencillo y bioquímicospasos chment de productos de escisión se puede evitar. El paleo-método se puede extender fácilmente a (i) experimentos de tiempo de los cursos que controlan la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica y (ii) el análisis de la proteólisis en muestras biológicas complejas que representan las condiciones fisiológicas. Paleo-timecourse experimentos ayudan a identificar limitación de la velocidad de procesamiento y pasos intermedios de reacción en situaciones complejas de reacciones proteolíticas vía. Además, el paleo-reacción nos permite identificar las enzimas proteolíticas tales como la tripsina proteasa de serina que es capaz de volver a enlazar sus productos de escisión y catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18. Tales "doble etiquetado" enzimas se pueden utilizar para postdigestion 18 O-etiquetado, en la que los péptidos están etiquetados exclusivamente por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Nuestra tercera estrategia se extiende etiquetado empleando 18 O agua enriquecida más allá de las enzimas y utiliza las condiciones ácidas de pH para introducir 18 O-isótopo estable signoturas en péptidos.
Mediante la combinación de etiquetado de isótopos estables y de alta resolución de la espectrometría de masas en una manera resuelta en el tiempo, el método de paleo-timecourse permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. El ensayo se puede utilizar para generar péptidos marcados con isótopos estables para estudios de proteómica cuantitativos y cualitativos, y para evaluar la cinética por el que los péptidos proteotípicos se generan. Además, paleo-timecourse está diseñado para…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR subvención 1R01DE019796.
Name of material | Company | Catalogue number |
PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
Name of reagent | Company | Catalogue number |
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
Trypsin Gold | Promega | V5280 |
Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents