Snabb Fibroblast Borttagning med hög densitet mänskliga embryonala stamcellskulturer
Summary
Trots pågående insatser övergångsregler kulturer till feeder-fria förhållanden, härledning och kultur av mänskliga embryonala stamceller (hESC) i stort sett är beroende av co-kulturer med mus embryonala matare (MEF). Här visar vi en ny metod för att snabbt avlägsna matare från hESC kulturer före experiment.
Abstract
Mus embryonala fibroblaster (MEF) användes för att fastställa mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kulturer efter blastocyst isolering 1. Denna feeder systemet upprätthåller hESCs från att genomgå spontan differentiering under cellens expansion. Emellertid är detta samarbete odlingsmetod arbetsintensiv, kräver välutbildad personal, och ger låg hESC renhet 4. Många laboratorier har försökt minimera antalet matarceller i hESC kulturer (dvs. innefattande matris-belagda skålar eller andra feeder celltyper 5-8). Dessa modifierade odlingssystem har visat några löften, men har inte ersatt standardmetoden för odling hESCs med mitomycin C-behandlade fibroblaster mus embyronic i syfte att fördröja oönskad spontan differentiering av hESC kulturer. Därför bör feeder celler som används i hESC expansionen avlägsnas under differentiering experiment. Även om flera tekniker finns tillgängliga för att rena hESC colonies (FACS, Mac eller användning av läkemedelsresistenta vektorer) från matare, dessa tekniker är arbetsintensiva, kostsamma och / eller destruktiv för hESC. Syftet med detta projekt var att uppfinna en metod för rening som möjliggör skörden av en renare population av hESCs. Vi har observerat att i en sammanhängande hESC kultur kan MEF befolkningen tas bort med hjälp av en enkel och snabb aspiration av MEF arket. Detta avlägsnande är beroende av flera faktorer, inklusive laterala cell-till-cell-bindning av MEF som har en lägre bindningsaffinitet till styren odlingsskålen, och förmågan hos kolonierna stamceller att driva fibroblasterna utåt under alstringen av sin egen " nisch ". Den hESC undersöktes sedan för SSEA-4, Oct3 / 4 och Tra 1-81 uttryck upp till 10 dagar efter MEF bort för att säkerställa upprätthållandet av pluripotens. Dessutom var hESC kolonier kunna fortsätta växa från i större formationer efter MEF bort, vilket ger ytterligare en nivå av hESC expansion.
Protocol
Discussion
Metoden som presenteras i detta manuskript erbjuder en snabb och mindre kostsamt alternativ till att eliminera celler fibroblast feeder från humana embryonala cellkulturer. Den framgångsrika avlägsnandet av fibroblaster är beroende av förekomsten av ett tätt sammanflytande monoskikt av dessa celler som utvecklas i längre stamcellskulturer. Efter 7-10 dagar, kommer de växande hESC kolonierna skjuta feeder fibroblaster i riktning utåt, vilket ger en allt tätare fibroblast monolager mellan kolonier. De starka cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av en ny fakultet Award II från California Institute of regenerativ medicin (RN2-00.921-1), och en NIH-finansierad Forsknings Award (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
