Hurtig Fibroblast fjernelse fra High Density humane embryonale stamceller Cultures
Summary
Trods den stadige bestræbelser på at overgangen kulturer til feeder-fri betingelser, forbliver afledning og dyrkning af humane embryonale stamceller (hESC) i høj grad afhængig af co-kulturer med muse embryonale foderautomater (MEF). Her viser vi en ny metode til hurtigt at fjerne foderautomater fra hESC kulturer før eksperimenteren.
Abstract
Muse embryonale fibroblaster (MEF) blev anvendt til at etablere humane embryonale stamceller (hESCs) kulturer efter blastocyst isolering 1. Denne feeder system opretholder hESCs fra undergår spontan differentiering under celleekspansion. Men denne co-dyrkningsmetode er arbejdskrævende, kræver højt uddannet personale, og renterne lave hESC renhed 4. Mange laboratorier har forsøgt at minimere antallet af fødeceller i hESC kulturer (dvs. inkorporering matrix-coatede skåle eller andre feeder celletyper 5-8). Disse modificerede kultursystemer har vist nogle lovende, men har ikke fortrængt standard fremgangsmåde til dyrkning hESCs med mitomycin C-behandlede muse embyronic fibroblaster for at forsinke uønsket spontan differentiering af hESC kulturer. Derfor bør feeder celler anvendt i hESC ekspansion fjernes under differentiering eksperimenter. Skønt adskillige teknikker er tilgængelige til oprensning af hESC colonies (FACS, Mac, eller brug af resistente vektorer) fra foderautomater, disse teknikker er arbejdskrævende, omkostningskrævende og / eller ødelæggende for hESC. Formålet med dette projekt var at opfinde en metode til oprensning, der muliggør høst af en renere population af hESCs. Vi har observeret, at i en konfluent hESC kultur kan MEF populationen fjernes med en enkel og hurtig aspiration af MEF arket. Denne fjernelse er afhængig af flere faktorer, herunder lateral celle-til-celle-binding af MEF'er, som har en lavere bindingsaffinitet til styren dyrkningsskål, og evnen hos stammen cellekolonier at skubbe fibroblasterne udad under dannelsen af deres egen " niche ". The hESC blev derefter undersøgt for SSEA-4, Oct3 / 4 og Tra 1-81 ekspression op til 10 dage efter MEF fjernelse for at sikre opretholdelse af pluripotency. Desuden hESC kolonier var i stand til at fortsætte med at vokse fra i større formationer efter MEF fjernelse, hvilket giver et ekstra niveau af hESC ekspansion.
Protocol
Discussion
Fremgangsmåden præsenteres i dette manuskript tilbyder en hurtig og mindre kostbart alternativ til at fjerne fibroblast-feeder-celler fra humane embryoniske cellekulturer. Den vellykkede fjernelse af fibroblaster er afhængig af tilstedeværelsen af en tæt konfluent monolag af disse celler, der udvikler sig i længere stamcellekulturer. Efter 7-10 dage vil de voksende hESC kolonier skubbe feeder fibroblaster i en udadgående retning, genererer en stadig tæt fibroblast monolag mellem kolonier. De stærke celle-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af et nyt fakultet Award II fra California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00.921-1), og en NIH-finansieret National Research Award (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
