למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.
Abstract
פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שמשו להקמת תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תרבויות לאחר בידוד הבלסטוציסט 1. מערכת זו שומרת על מזין hESCs מעובר התמיינות ספונטנית במהלך התרחבות תא. עם זאת, שיטה זו משותפת התרבות היא עבודה אינטנסיבית, דורשת כוח אדם מיומן, וטוהר hESC נמוך תשואות 4. מעבדות רבות ניסו למזער את מספר התאים מזינים בתרבויות hESC (כלומר שילוב מנות מטריצה מצופות או סוגי תאים אחרים מזין 5-8). מערכות תרבות שונות אלו הראו תוצאות מבטיחות, אבל עדיין לא החליפו את השיטה הסטנדרטית לhESCs culturing עם fibroblasts embyronic עכבר C שטופל בmitomycin כדי לעכב בידול ספונטני לא רצוי של תרבויות hESC. לכן, התאים המזינים המשמשים בהרחבת hESC יש להסיר במהלך ניסויי בידול. למרות מספר טכניקות זמינות לטיהור שיתוף hESClonies (FACS, מקים, או שימוש בסמי וקטורים עמידים) ממתקני האכלה, טכניקות אלה הן עבודה אינטנסיביות, יקרים ו / או הרסני לhESC. מטרתו של פרויקט זה הייתה צריך להמציא שיטה לטיהור שמאפשרת הקצירה של אוכלוסייה טהורה של hESCs. אנו מציינים כי בתרבות hESC מחוברת, אוכלוסיית MEF ניתן להסיר באמצעות שאיפה פשוטה ומהירה של גיליון MEF. הסרה זו תלויה במספר גורמים, כולל קשירה לרוחב תא לתא של MEFs שיש זיקה מחייבת נמוכה למנת תרבות סטירן, והיכולת של מושבות תאי הגזע לדחוף את fibroblasts החיצוני בדור שלהם " נישה ". HESC היה אז נבדק לSSEA-4, Oct3 / 4 ו1-81 ביטוי Tra עד 10 ימים לאחר הסרת MEF כדי להבטיח תחזוקה של pluripotency. יתר על כן, מושבות hESC היו מסוגלות להמשיך ולצמוח מהם לתצורות גדולות יותר לאחר הסרת MEF, מתן רמה נוספת של התרחבות hESC.
Protocol
1. הכנה מתעלקת עכבר עוברי MEFs שימוש בשיתוף תרבות hESCs יש לטפל קודם לכן על ידי הקרנה או mitomycin-C כדי לעכב את התאים עוברים מחטיבה. שעות לפני זריעת MEF, מעייל כל פלזמה 60 מ"מ טופלו מנת התרבות עם 2 מ"ל …
Discussion
השיטה שהוצגה בכתב היד הזה מציעה אלטרנטיבה מהירה וזול יותר לחיסול תאים מזינים פיברובלסטים מתרביות תאים עובריות אנושיות. ההסרה המוצלחת של fibroblasts תלויה בקיומו של monolayer חוזקה confluent של תאים אלה שמתפתחים בתרביות תאי גזע ארוכות יותר. לאחר 7-10 ימים, מושבות hESC הגוברות לדחוף את …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי פקולטה לפרס שני חדשה ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (RN2-00921-1), ופרס לאומי למחקר NIH במימון (F32-HL104924)
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments (optional)
DDR2
Santa Cruz
7555
Fibroblast Marker
Dapi
Calbiochem
268298
Cell Nucleus Marker
SSEA-4
Millipore
MAB4304
Human ESC Marker
Oct 3/4
Santa Cruz
9081
Human ESC Marker
Flk-1
BD Pharma
555307
Early Differentiation Marker
Tra-1-81
Acris
AM20377AF4-S
Human ESC Marker
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
Turner, W. S., McCloskey, K. E. Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures. J. Vis. Exp. (68), e3951, doi:10.3791/3951 (2012).