一个系统<em>体外</em培养的胚胎胰腺

Summary

在这里，我们描述了一个小鼠胚胎胰腺分离，培养和操纵方法。这是一个极好的<em>体外</em系统为研究胰腺发育的各个方面，包括形态，分化和生长。胰芽外植体可以培养数天，并用于在一个范围内的不同的应用程序，包括整体安装免疫荧光和实时成像。

Abstract

胰腺控制我们的身体重要的功能，包括消化酶和调节血糖水平的生产。虽然在过去的十年中，许多研究都促成了坚实的基础，为了解胰腺器官，重要的差距仍然存在在我们的知识的早期胰腺形成^2。将提供一个完整的了解，这些早期事件的洞察这个机构的发展，也成为目标的胰腺疑难杂症，如糖尿病和胰腺癌。最后，这些信息将产生发展的背景下，糖尿病的细胞替代疗法的蓝图。

在胚胎发育过程中，胰腺源于不同的胚胎副产物的背，腹肠胚层在胚胎天（E）9.5在小鼠胚胎^3,4。这两种副产物向外翻固体上皮细胞周围的间充质升芽，进行增殖，分支和分化的产生一个完全成熟的器官^2,5,6。最近的证据表明，生长和分化的胰腺细胞谱系，包括产生胰岛素的β细胞，依赖于适当的组织架构，上皮重构和细胞定位分支胰腺上皮内^7,8。然而，如何分支形态发生与细胞增殖和分化的胰腺中的协调在很大程度上是未知的。这部分是由于这些发育过程的了解，目前几乎完全依赖于固定标本的分析，而形态发生的事件是高度动态的。

在这里，我们提出一个用于解剖的方法和培养小鼠胚胎胰腺芽体外玻璃 ​​底的菜肴，可以直接可视化的胰腺（ 图1）。这个邪教余吕杏茜系统是理想的设计，激光扫描共聚焦显微镜，特别是活细胞成像。胰腺外植体可以不仅从野生型小鼠胚胎制备，但也从遗传工程小鼠品系（ 例如转基因或基因敲除），允许实时的突变表型的研究。此外， 体外培养系统是值得研究的化学化合物对胰腺发育的影响，从而获得定量数据的增殖和生长，延伸，分支，tubulogenesis和分化。总之，的体外胰腺外植体培养法结合高分辨率成像的发展提供了一个强大的平台，观察形态发生和分化的事件发生，因为他们在发育中的小鼠胚胎。

Protocol

已经适应这里描述的协议，从技术最初描述的波斯 ​​富街和松弛9共聚焦显微镜和优化。 1。涂层的玻璃底培养皿应进行以下步骤，在无菌条件下在层流罩中。 胰腺外植体培养在35毫米的培养皿中，用直径为20毫米的玻璃微孔底部公司（ 例如 MatTek Corporation）。使用一个玻璃底菜，每外植体培养的整个期间的文化。在一天前的胰芽?…

Discussion

胰腺癌的命运一旦被指定，进行广泛的胰腺祖细胞的增殖，分化和形态，最终形成一个成熟的，功能性的器官^2,4。目前，如何分支发生在胰腺和它是如何连接到祖细胞增殖和分化在很大程度上是未知的。胰腺外植体培养代表阐明这些过程的体外 ^5,9,11一个理想的系统。与早期胰腺癌芽体外植活细胞成像相结合，可以得到一个清晰的画面在胚胎胰腺形态发生过程中发生?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1