Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

אנו מתארים את הכנת גורם תא T צמיחה המשמש הרחבה של מבחנה של אנטיגן ספציפי לערמונית קווי עכברוש T לימפוציטים.

Abstract

תחזוקה של אנטיגן ספציפי לערמונית T שורות תאים או שיבוטים בתרבות דורש הפעלת סיבובים של אנטיגן-Induced מופרדות שלבי 1,2 הרחבת התא. תוספת של אינטרלוקין 2 לתקשורת התרבות בשלב ההתרחבות נחוצה כדי למנוע מוות של תאים ו מספיק כדי לשמור לטווח קצר שורות תאים T אבל הוכח להגדיל Th1 קיטוב 3. החלפה של אינטרלוקין 2 בפקטור תא T צמיחה (TCGF) אשר מכיל תערובת של ציטוקינים הוא יעיל יותר מאשר אינטרלוקין 2 בשמירה לטווח ארוך שורות תאים T במבחנה 3. יתר על כן, TCGF יכול בקלות להיות מוכנים בכמויות גדולות במעבדה, והוא הרבה יותר זול מאשר רקומביננטי אינטרלוקין 2.

כאן, אנו מראים כיצד להכין TCGF מ supernatants עכברוש splenocyte תרבות. במשך התהליך הזה, שאנחנו קוצרים spleens מ נאיבי חולדות לואיס מורדמים עבור התימוס ואיסוף הדם. אנחנו מכינים תא בודד השעיות מן spleens, lyze את כדוריות הדם האדומות של הלם אוסמוטי, ואת הזרע splenocytes במדיום תרבות. התאים מגורה עם concanavalin, mitogen כי הלא סלקטיבי מפעיל כל T לימפוציטים עכברוש, וישכנע את הייצור של ציטוקינים. Supernantant תרבות נאסף 48 שעות לאחר מכן concanavalin andexcess חייב mannoside מתיל אלפא כדי למנוע את הפעלת הקווים תא T אשר TCGF יתווספו. TCGF אז הוא סטרילי, מסונן, aliquoted, ומאוחסנים ב -20 ° C.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. קח spleens לואיס חולדה (חולדות בין 160-200 הם הטובים ביותר). Dilacerate על קרח בצלחת פטרי המכילות PBS + אנטיביוטיקה (PBS-PS) בעזרת מסננת התא. שים בתוך שפופרת 50 מ"ל. מלא עם PBS-PS.
  2. ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
  3. לשטוף את התאים פעמיים.
  4. Resuspend גלולה ב NH 4 Cl 0.15 מ '(5 מ"ל לכל טחול). מערבבים בעדינות עם pipet ברציפות למשך 3 דק 'על קרח lyse אריתרוציטים. מלאו את הצינור עם המדיום.
  5. ספין של 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
  6. לשטוף את התאים פעמיים.
  7. ספירת התאים. הטחול עכברוש נותן 200-250000000 תאים.
  8. זרעים התאים ב -2 מיליון דולר מ"ל במדיום שלם: 50 מ"ל לכל בקבוק 75 ס"מ 2.
  9. תנו לגדול במשך 48 שעות בחממה.
  10. ספין 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
  11. אסוף את supernatant; להשליך את התאים.
  12. הוסף 15 מ"ג / מ"ל ​​mannoside מתיל אל supernatant. מערבבים היטב.
  13. מסנן (0.2 מ"מ)
  14. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים במקרה הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנחנו מכינים TCGF מ splenocytes לואיס עכברוש מאז שאנחנו בקביעות להרדים חולדות נאיבי מהמאמץ הזה לקצור בסרום thymi לעורר לואיס עכברוש T שורות תאים במבחנה. TCGF זה יכול לשמש כדי לקדם את הצמיחה ואת ההישרדות של שורות תאים T מ זני עכברים אחרים. TCGF יכול גם להיות מוכנים מן זנים אחרים של חולדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter