Summary
Systematiske, store syntetiske genetiske (gen-gen eller epistasis) interaktion skærme kan bruges til at udforske genetiske redundans og pathway cross-talk. Her beskriver vi en high-throughput kvantitativ syntetisk genetisk array-screening teknologi, kaldet eSGA, som vi udviklede for at kunne belyse epistatic relationer og udforske genetiske interaktion netværk i
Abstract
Fænotyper bestemmes af en kompleks serie af fysiske (fx protein-protein) og funktionelt (fx gen-genet eller genetisk) interaktioner (GI) 1. Mens fysiske samspil kan angive, hvilke bakterielle proteiner er forbundet som komplekser, de ikke nødvendigvis afsløre forløb-niveau funktionelle relationships1. GI skærme, hvor væksten af dobbelte mutanter, der bærer to deleterede eller inaktiverede gener er målt og sammenlignet med de tilsvarende enkelte mutanter, kan belyse epistatisk afhængigheder mellem loci og således tilvejebringe et middel til at forespørge og opdage nye funktionelle relationer 2. Storstilede GI maps er blevet rapporteret for eukaryote organismer som gær 3-7, men GI oplysninger forbliver sparsom til prokaryoter 8, som hindrer den funktionelle annotation af bakterielle genomer. Til dette formål har vi og andre har udviklet high-throughput kvantitative bakterielle GI screeningsmetoder 9, 10
Her præsenterer vi de vigtigste skridt, der er nødvendige for at udføre kvantitativ E. coli Syntetisk Genetisk Array (eSGA) screening procedure på en genom-skala 9 under anvendelse af naturlige bakteriel konjugation og homolog rekombination til systemisk generere og måle egnethed stort antal dobbelte mutanter i en koloni-array format. Kort fortalt en robot til at overføre , gennem konjugation, chloramphenicol (Cm) - mærket mutantalleler fra manipuleret Hfr (Høj frekvens af rekombination) "donor stammer 'i en ordnet række af kanamycin (Kan) - mærkede F-modtager stammer. Typisk bruger vi tab af funktion enkelte mutanter, der bærer ikke-essentielle gendeletioner (fx "Keio 'indsamling 11) og væsentlige gen hypomorphic mutationer (dvs. alleler giver nedsat protein ekspression, stabilitet eller aktivitet 9, 12, 13) til forespørge de funktionelle sammenslutninger af ikke-essentielle og væsentlige gener, Respectively. Efter konjugering og efterfølgende genetisk udveksling medieret ved homolog rekombination, er de resulterende dobbelte mutanter udvælges på fast medium indeholdende begge antibiotika. Efter udvækst er pladerne digitalt afbildes og koloni størrelser er kvantitativt scoret med en intern automatiseret billedbehandlingssystem 14. Geografiske betegnelser bliver afsløret, når vækstraten for en dobbelt mutant er enten væsentligt bedre eller dårligere end forventet 9. Skærpende (eller negativ) geografiske betegnelser ofte resultere mellem tab af funktion mutationer i par af gener fra kompenserende veje, der har indvirkning på den samme væsentlige proces 2. Her, er tabet af en enkelt gen pufret, således at enten enkelt mutant er levedygtig. Men tabet af begge veje er skadelig og resulterer i syntetisk letalitet og sygdom (dvs. langsom vækst). Omvendt kan lindre (eller positive) interaktioner forekomme mellem gener i den samme vej eller proteinkompleks 2 somdeletion af begge gener alene er ofte tilstrækkelig til at forstyrre den normale funktion af vejen eller komplekse således, at yderligere perturbationer ikke svækker aktiviteten og dermed vækst, yderligere. Samlet set kan systematisk identificere og analysere GI net give uvildige, globale kort over de funktionelle relationer mellem et stort antal gener, hvorfra forløb-niveau information savnet af andre tilgange kan udledes 9.
Protocol
1. Constructing HFR Cavalli Donor mutantstammer ved Recombineering 15, 16
Trinnene til konstruktion af eSGA donor pletter er beskrevet nedenfor. Kort fortalt bruger vi målrettet λ - Rød medieret homolog rekombination 16 af amplificeret selekterbare DNA-markør kassette fragmenter genereret ved PCR for at skabe ikke-essentielt gen deletionsmutanter (afsnit 1,1) eller essentielt gen hypomorphic mutant donor stammer (afsnit 1,2), der derefter bruges som forespørgsler »definere GI netværk.
Bemærk: Under den teknologi udviklingsprocessen, vurderede vi effektiviteten af at anvende Hfr-medieret konjugativ overførsel til at kombinere mutationer ved anvendelse af en veldefineret Hfr donorstammen (Hfr Cavalli, Hfr Hayes, og Hfr 3000). Vi undersøgte (i) evnen til effektivt at gøre donor mutanter ved hjælp af recombineering metode udviklet af Yu et al. (2000) 16, (ii) de relative effektiviteteraf konjugative DNA-overførsel af forskellige kromosomale markører, og (iii) virkningerne af forespørgslen genet position og kromosomale orientering i forhold til Hfr transfer locus, oriT. Vi fandt, at λ - Red-medieret homolog rekombination effektivitet var meget højere i Hfr Cavalli end i Hfr Hayes eller Hfr3000. Om nødvendigt kan P1 transduktion eller en pseudo Hfr-stamme 17, bruges til at skabe mutante donorer. Har vi med succes tilpasses alle disse fremgangsmåder til fremstilling og screening af store antal af donorer. Da der i vores forsøg konjugationsfremgangsmåder eksperimenter, den samlede effektivitet af overførsel og antallet af tidligere conjugants observerede var signifikant større med Hfr Cavalli, blev denne særlige stamme baggrund valgt til donor byggeri og store eSGA. Alle procedurer for eSGA skærme med HFR Cavalli donorer er beskrevet.
- Amplificering af DNA-fragmentet til efterfølgende recombineering at slette en ikke-essentielt gen
Ansæt to-trins nested PCR forstærkeredelse (figur 1) at skabe en gendeletion kassette til erstatning af målet åben læseramme med en Cm resistensmarkør fra pKD3 plasmidet (GI: 15554330; protein id: AAL02033.1) 15. Markøren er flankeret af FRT-steder 11 tillader fjernelse af resistensgenet, om nødvendigt i opfølgende forsøg.
Bemærk: Vi har indlejret to-trins PCR for at fjerne plasmid fra det amplificerede produkt, der anvendes efterfølgende til at transformere bakterielle celler. Fjernelse af plasmidet (i den første PCR) og derefter skabe gen-knockout kassetten i den anden PCR er nødvendig, fordi transformation med et plasmid er meget mere effektiv end recombineering, og målet er at opnå - så vidt muligt - kun stammer, som har succesfuldt erstattet målrettet genomisk DNA med den selekterbare markør. Et alternativ til nested PCR er at udføre en restriktionsfordøjelse af plasmidet uden for regionen amplificeret i den anden PCRtrin. Derefter blev produktet af restriktionsfordøjelse oprenses og anvendes som en skabelon i det nestede PCR trin (1.1.2). Denne mulighed er også enkel, men kræver mere arbejde op tid.- Brug omkring 45 ng pKD3 som en skabelon i PCR med fremadrettet F1 og revers R1 primere for at fremstille et 1070 bp produkt. Oprense PCR fragment under anvendelse af Qiagen PCR-oprensningsprotokol, og fortynde produktet i sterilt destilleret vand til 5 ng / pl koncentration.
- Ved hjælp af det oprensede PCR-produkt som template, oprette en anden PCR med genspecifikke (f.eks knockout) nestede primere, F2 og R2, som har (i) 45 nt af genspecifikke homologi regioner ved 5'-ender for at tillade til homolog rekombination umiddelbart opstrøms og nedstrøms for målgenet at erstatte det med den Cm resistens-markøren, og (ii) 20 nt ved 3'-ender til at prime syntesen af Cm markør. Størrelsen af det producerede fragment er 1123 bp. De genspecifikke homologi regioner er designet til at fjerne målet open læseramme mens de tilstødende eller delvist overlappende kodende segmenter intakt. Efter denne forstærkning, skal du fortsætte til trin 1,3.
- Amplifikation af et mærkningsmateriale kassette for at skabe et essentielt gen hypomorphic mutation
- Til konstruktion hypomorphic donor mutantstammer, tilføje et C-terminalt sekventiel peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofte let påvirker afgørende proteinfunktion den destabiliserende transkript overflod (dvs. protein kopital) eller proteinfoldning / aktivitet. Til dette formål en selekterbar SPA-tag (SPA-Cm) DNA-template skaber ved at konvertere Kan resistens markør i pJL148 18 til Cm under anvendelse recombineering mellem identiske nukleotidsekvenser flankerer Kan markør i pJL148 og Cm markør i pKD3 15. Den resulterende skabelon består af i-ramme SPA-tag, efterfulgt af en Cm resistensmarkør, og er egnet til PCR-amplifikation, recombineering og efterfølgende eSGA 12.
Bemærk: </ Strong> essentielle gener er potentielt de mest interessante for genfunktion undersøgelser. Men fordi disse gener ikke kan slettes, innovative metoder måtte blive udviklet for at undersøge de funktionelle relationer af væsentlige gener. Flere egnede meget succesfulde fremgangsmåder er blevet udviklet indledningsvis i gær. Fx. Davierwala et al (2005) 19 udførte GI skærme med et panel af 575 temperaturfølsomme essentielt gen mutanter, og fandt at essentielle gener udviste omkring fem gange antallet af soldater som ikke-essentielle gener. Ligeledes, Breslow et al. (2008) 20 udviklet en "reduceret forekomst af mRNA perturbation« (DAMP) fremgangsmåde til at generere et bibliotek af hypomorphic alleler dækker ~ 82% af essentielle gærgener at studere veje og komplekser. Den fugtige fremgangsmåde modificerer 3'-enden af det udtrykte mRNA, reducere niveauet af målgenet 6, sandsynligvis på grund af mRNA-destabilisering. Svarende til den fugtige strategi 6, vores strategy har været at udnytte de subtile virkninger af forstyrrende 3'-enden af det udtrykte mRNA af essentielle proteiner.
Som vi beskriver nedenfor, er mærket i sig selv sandsynligvis ikke påvirker proteinfoldning eller funktion, men den subtile forstyrrelse af mRNA ved taggen er tilstrækkelig, når den kombineres med miljøbelastning eller andre mutationer, for at afsløre funktionelt informative gen-miljø 13 og genet -gen 9, 12 interaktioner.
For det første til dato, vi brugte SPA-tags til at rense ~ 3.000 essentielle og ikke-essentielle E. coli-proteiner 21-23, med over 80% af de 307 E. coli essentielle proteiner, der er repræsenteret blandt vores SPA-mærkede stammer 8. Idet mærket med succes blev anvendt til at isolere kendte protein-komplekser, som blev gensidigt valideret (dvs. det samme kompleks kan isoleres ved kodning og oprensning af forskellige proteiner fra samme kompleks), og de isolerede komplekser var biologisk relevant, vi fordi etiketterne gørenormalt ikke påvirke proteinfoldning eller-funktion 12. Tilsvarende vores upublicerede observationer afslørede, at etiketten i sig selv ikke påvirker normalt stamme vækst. Men vi ræsonnerede, at ændre 3'-UTR ved at integrere tag og markør kassetten, som blev rapporteret for Damp stammer 6, kunne destabilisere visse udskrifter på RNA-niveau eller, i sjældne tilfælde, den korrekte foldning eller funktion hindre fusionsproteiner. Derfor forudså vi, at kombinere en sådan forstyrret alleler af essentielle gener med andre funktionelt relevante mutationer andre steder i genomet ville resultere i informative geografisk betegnelse, hvilket faktisk blev observeret 9, 12. Desuden SPA-mærkede alleler af essentielle gener udviste gen-miljø interaktioner (fx overfølsomhed over for medicinen) i henhold til den fænotypiske profilering arbejde af Nichols et al. (2011) 13, der underkastes en delmængde af SPA-mærkede væsentlige stammer til mange forskellige vækstbetingelser. Den samme undersøgelse confirmed, at de fleste (54 ud af 58 testede) SPA-mærket væsentlige stammer viste nedsat fitness i en eller flere dyrkningsbetingelser 13, hvilket understøtter forestillingen om, at SPA-tag skaber ofte milde hypomorphic alleler i essentielle gener, der er nyttige for genom-dækkende GI skærm applikationer, herunder eSGA. - Amplificere tagging kassetten fra SPA-Cm-skabelon ved hjælp af genspecifikke primere S1 og S2, der hver indeholder (i) en 45 nt genspecifik region for homolog recombineering ved 5'-enden, efterfulgt af (ii) en 27 bp SPA- cm specifikke sekvens ved 3'-enden.
- Til konstruktion hypomorphic donor mutantstammer, tilføje et C-terminalt sekventiel peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofte let påvirker afgørende proteinfunktion den destabiliserende transkript overflod (dvs. protein kopital) eller proteinfoldning / aktivitet. Til dette formål en selekterbar SPA-tag (SPA-Cm) DNA-template skaber ved at konvertere Kan resistens markør i pJL148 18 til Cm under anvendelse recombineering mellem identiske nukleotidsekvenser flankerer Kan markør i pJL148 og Cm markør i pKD3 15. Den resulterende skabelon består af i-ramme SPA-tag, efterfulgt af en Cm resistensmarkør, og er egnet til PCR-amplifikation, recombineering og efterfølgende eSGA 12.
- Bekræfter og oprensning af PCR-produkt
- Bekræfte, at kodning kassetten korrekt blev amplificeret ved at underkaste 2-5 ul af PCR-produktet til agarosegelelektroforese og oprense den resterende DNA følge producentens standard PCR oprensningsprotokol (Qiagen). Eluere PCR-produktet i 30 pi sterilt destilleret vand og fortyndes til ~ 50 ng / gl koncentration. The rensed produkt kan anvendes straks i transformation (trin 1.5) eller opbevaret ved -20 ° C i op til 6 måneder, indtil brug.
- Fremstilling af HFR Cavalli kompetente celler for donor konstruktion
- Inokulere en ml af mættet overnatskultur af en Hfr Cavalli-stamme i 70 ml frisk Luria-Bertani (LB) medium med 35 ml 50 ug / ml ampicillin i en 250 ml kolbe. Inkuber kulturen ved 32 ° C med omrystning ved 220 rpm, indtil en optisk densitet (OD) 600 nm på ~ 0,5 til 0,6 opnås (~ 2 timer).
- Overføre kulturen til et vandbad til varmeinduktion af λ røde rekombination system 16 ved 42 ° C i 15 minutter med rystning ved 160 rpm. Stop induktionen ved at overføre kulturen til en afkølet is-opslæmning vandbad i 10-20 min ved 160 rpm. Sørg for at holde cellerne kold fra dette punkt indtil efter transformation, bruge rør og kuvetter, der er blevet kølet på is i mindst 15 min inden brug.
- Fordel cULTUR ligeligt i to nedkølede 50 ml polypropylenrør (~ 35 ml kultur pr rør) og centrifugeres ved 4.400 x g i 6 min ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten ved forsigtig vending i ~ 50 ml iskoldt sterilt destilleret vand. Centrifugeres cellerne igen ved 4.400 x g i 6 min ved 4 ° C. Bortkast supernatanten og resuspender hver cellepellet i 20 ml iskold steril 10% glycerol og centrifugeres igen som beskrevet ovenfor.
- Supernatanten dekanteres fra, og resuspender cellepelleten i 500 pi iskold 10% glycerol. Alikvot de fremstillede kompetente celler i 50 pi volumener i individuelle, præ-kølet 1,5 ml mikro-centrifugeglas til øjeblikkelig transformation. Cellerne kan fryses på tøris eller flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i op til 3 måneder. Imidlertid transformationseffektivitet er højest med frisk fremstillede kompetente celler.
- Transformation
- Tilsæt 100 ng af oprenset PCR-produkt fratrin 1.3.1, til de kompetente celler. Svirp røret og tillade suspensionen at sidde på is i 5 min.
- Overfør suspensionen iskold kompetente celler og DNA til en forud kølet elektroporation cuvette. Elektroporere celleblandingen med 2,5 kV, 25 uF, 200 ohm indstilling i en 2 mm hul kuvette (dvs. hvis du bruger en anden cuvette, se venligst fabrikantens anvisninger for elektroporation indstillinger), og straks tilføje 1 ml stuetemperatur SOC medium. Overfør elektroporerede celler i SOC-medium i et 15 ml dyrkningsrør og inkuberes ved 32 ° C i 1 time med orbital omrystning ved 220 omdr.lminut.
- Efter inkubation centrifugeres celler ved 4.400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjerne ca 850 pi af supernatanten og resuspender cellepelleten i den resterende væske.
- Sprede cellerne på forvarmet LB-plader indeholdende 17 ug / ml Cm og inkuber ved 32 ° C natten over. Pick to individuelle transformantkolonier og streak ud på LB-Cm plader til mutant bekræftelse. Vi anbefaler at man undgår største transformantkolonier med henblik på at mindske risikoen for at plukke stammer med sjældne suppressor mutationer. Også streak de samme transformanter på LB-Kan at bekræfte, at stammerne ikke er Kan resistente.
Bemærk: Da Cm resistensmarkøren bruges til at gøre donor stammer, forventer vi ikke donor mutanter at være Kan resistente. Ved udstrygning af transformanterne på både LB-Kan og LB-Cm plader, sikrer vi, at donor-mutationen ikke selv har en eller anden måde forårsage Kan modstand. Hvis dette trin ikke blev udført, og de målrettede mutationer var at påvirke evnen af stammen til at overleve på Kan, ville dobbelte mutanter ikke gøres effektivt ved hjælp eSGA siden donor stammer vil overleve alle udvælgelsesafgørelser trin. Dette er blot en forebyggende logisk skridt at fange uventede fænotyper eller andre problemer, der kan forstyrre afslutningen af eSGA skærme. Hvis dette trin blev sprunget over, anden kontrol woulD stadig identificere fejlslagne skærme. Imidlertid vil en tidligere påvisning af en donor, der er resistent over for Kan eliminere en række uproduktive og unødvendige trin. Andre mulige årsager til en stamme til at vokse på Kan kan f.eks udløb antibiotika såvel som anvendelsen af et forkert PCR-produkt eller en stamme til transformation. Alle disse spørgsmål kan identificeres og behandles tidligt i proceduren ved hjælp af denne kontrol, som ikke er krævet, men anbefales til eSGA.
- Bekræftelse af ikke-essentielle gendeletion (trin 1.6.1) eller essentielt gen hypomorphic mutation (afsnit 1.6.2)
Bemærk: Når bekræfter gendeletion ved PCR, bør genomisk DNA fra en vildtype-stamme anvendes som en kontrol.- Bekræfter ikke-essentielt gen deletion
- For at bekræfte gendeletion ved PCR, isolere det genomiske DNA fra de transformerede, formodede knockout-stammer dyrket i flydende LB-Cm medium efter manufacturer anvisninger (Promega).
- For at bekræfte succesfuld recombineering, amplificere DNA fra hver transformant med tre forskellige sæt af knockout bekræftelse primere. Udføre reaktionerne med ~ 150 ng genomisk DNA-skabelon, og bekræfte de korrekte fragmentstørrelser ved at køre PCR-syntetiserede produkter på en agarosegel.
- Det første primersæt består af en 20-nt flankerende primer, som ligger 200 bp opstrøms for målområdet (KOCO-F), og CM-R primer, som er komplementær til den Cm kassette sekvens. Denne amplifikation forventes at frembringe et 445 nt amplikon i mutanten, men ikke i vild type stammen (figur 1).
- Det andet sæt indeholder en fremadrettet primer (Cm-F), annealing til Cm kassette sekvens og en 20-nt revers-flankerende bekræftelse primer (KOCO-R), som er designet til at anneale 200 bp nedstrøms for 3'-enden af fjernede gen. Denne amplifikationsreaktion forventes at frembringe et 309 nt amplikon i mutanten, men ingent i vildtypestammen (figur 1).
- Den tredje PCR indeholder KOCO-F og KOCO-R-primere. Denne reaktion er nødvendig for at bekræfte, at den valgte stamme ikke er merodiploiden, med et gen locus er blevet erstattet af kassetten og en anden duplikeret men ellers vildtype-genkopi stadig er til stede. Denne amplifikation fra en korrekt deletionsmutant forventes at give et 1,4 kb produktet (fig. 1).
Bemærk: Når målgenet har omtrent samme længde i basepar som gendeletion kassetten, vil man ikke bemærke en forskel på et locus, der er blevet erstattet af kassetten, og et locus, som ikke har. For en endelig bekræftelse i sådanne tilfælde anbefaler vi at anvende yderligere primere til specifikt at amplificere et DNA-segment inden for den slettede gen. I dette tilfælde, hvis genet er blevet deleteret, vil et amplifikationsprodukt der kun observeret i vild type kontrolstamme og ikke i mutanten. Disse primerekan være manuelt eller beregningsmæssigt designet til specifikt at amplificere et DNA-segment i den deleterede region. Vi typisk forstærke 140 bp regioner.
- Bekræfter essentielt gen hypomorphic mutation
- For at bekræfte den hypomorphic mutation ved PCR, anvendes genspecifikke 20-nt fremad (KOCO-F) og reverse primere (KOCO-R) placeret 200 bp opstrøms og nedstrøms for, den SPA-tag insertionssted (figur 2).
Bemærk: Dette amplifikationstrin anvendes som en kontrol for at sikre fravær af et ukodet kopi af målet essentielle gen. Når kun en mærket version er til stede, er et enkelt bånd 310 bp større end SPA-Cm amplicon observeret. Et 400 bp produkt ville signalere tilstedeværelsen af den umærkede version af genet. - Parallelt med PCR bekræftelse anvende Western-blotting til at kontrollere in-frame insertion af SPA-tag under anvendelse af et anti-FLAG-M2-antistof specifikt for FLAG-epitoper af SPA-tag 21.
- For at bekræfte den hypomorphic mutation ved PCR, anvendes genspecifikke 20-nt fremad (KOCO-F) og reverse primere (KOCO-R) placeret 200 bp opstrøms og nedstrøms for, den SPA-tag insertionssted (figur 2).
- Bekræfter ikke-essentielt gen deletion
- Lagring af bekræftede donorstammen
- Overfør natten over kultur af den bekræftede rekombinante donor mutantstamme til de mærkede kryohætteglas, supplere med glycerol til 15% slutkoncentration, og bland godt. For langtidsopbevaring, holde kryohætteglas ved -80 ° C.
2. Opstillingsindretningen E. coli F-Recipient Mutanter for eSGA Screens
- Replica-pin E. coli Keio én ikke-essentielt gen deletionsmutant samling genereret af Mori et al. (3968 stammerne 11, F-BW25113, kan fås fra Open Biosystems) robot til 24 384-brønds mikroplader indeholdende 80 gl af flydende LB-medium per brønd , suppleret med 50 ug / ml Kan.
Bemærk: For systematisk at vurdere geografiske betegnelser med essentielle gener, kan modtageren Keio Collection 11 suppleres med F-Kan-mærket essentielt gen hypomorphic mutantstammer med C-terminale SPA-tags 22, 23. - For at gøre plads til grænsekontrol stamme, der vil fungere som en positiv kontrol, støtte i inden for og mellem plade normalizations samt i automatiserede kolonier quantizations, skal du fjerne de podede medier fra de yderste brønde i hver plade fra ovenstående trin og overførsel til nye plader, atter giver de yderste brønde tomme.
Bemærk: grænsekontrol stamme JW5028 fra Keio kollektionen 11 udgår for en lille pseudo-gen, der ikke har og ikke i vores hel-genom-skærme, udviser geografiske betegnelser med eventuelle donorer. Derfor er dette en god positiv kontrol-stamme til at identificere sjældne tilfælde, når konjugering, pinning eller markeringer har slået fejl, hvilket resulterer i manglende eller sporadisk kant stamme vækst. For eksempel, hvis grænsekontrol kolonier ikke vokser efter den dobbelte mutant udvælgelse kan forespørgslen stammen ikke være i stand til konjugering, kan konjugering har været forsøgt ina tilstand, der forhindrede den i at finde sted (fx på en antibiotika-holdig plade) eller en forkert antibiotikum kan være blevet tilføjet til markeringen pladen. Tilsvarende, hvis meget få, sporadiske kolonier observeret på hele pladen, herunder grænsen, kan konjugation eller pinning er mislykkedes, og skærmen skal gentages. Hvis denne sporadiske grænse vækst er reproducerbar, kan det tyde konsekvent dårlige donor konjugering og dermed tilfælde, hvor dobbelte mutanter ikke overholdes, er muligvis på grund af konjugation fiasko, ikke sandt geografiske betegnelser. Sådanne skærme vil skulle kasseres fra yderligere analyse. Ved at være til stede på alle plader, tillader grænsekontrol stamme kolonien kvantisering software til automatisk at bestemme kolonidannende positioner på de dobbelte mutante plader og dermed koloni positioner ikke behøver at være afgrænset manuelt. Endelig grænsekontrol stammen hjælpemidler i normaliseringen af kolonidannende størrelser inden (fx forskellige rækker i en plade) og melEEN (fx forskellige modtagende plader fastgjort med samme donor på forskellige tidspunkter) plader. - Ligeledes skabe negative kontrol pletter ved at fjerne to vilkårlige stammer fra et andet sted i hver plade (ikke kant) og overføre belastninger til en ny plade. Udfylde disse tomme brønde med LB-medium indeholdende 17 ug / ml Cm. Disse negative kontrol spots forventes at være tom i modtageren og derfor dobbelt mutant plader og hjælpe med at sikre, at der ikke var nogen behandling eller pladehåndteringsapparat fejl, når nummerering, billedbehandling, eller pinning pladerne.
Bemærk: Disse tomme pletter er påkrævet negative kontroller. Negative kontroller hjælpe med at identificere tilfælde, hvor valg fejler - når negative kontrolstammer vokse under udvælgelsen. Vi foreslår, at ikke blot vælge unikke negativ kontrol pletter for hver af de modtagende plader, men også vælge negativ kontrol steder inden for samme kvadrant af pladen (f.eks nederst til højre). Denne måde mønstretaf den negative kontrol spots ville identificere mulige plade mishandling fejl (f.eks plader er fejlagtigt eller blive fastgjort på hovedet, hvor den øverste venstre koloni er fastgjort i nederste højre position). - Podes på Keio stammen JW5028 11, med et pseudogen deletion, i en 500 ml kolbe med 200 ml LB indeholdende 50 pg / ml Kan. Baseret på vores hel-genom eSGA skærme, vækst i netop denne mutant er tættest på naturen typen BW25113 og det er derfor brugt som en grænsekontrol.
- Grow de grupperede stammer samt JW5028 kultur natten over ved 32 ° C med 190 rpm orbital ryster med en OD på ~ 0,4 til 0,6 ved 600 nm. Efter vækst natten, udfylde de tilgrænsende brønde med omkring 80 pi JW5028 natten over kultur.
- De samlede plader kan anvendes i trin 3.2. Alternativt for langtidsopbevaring, supplerer hver brønd i modtagerlandene plader med 15% glycerol, bland medierne og glycerol, og holde pladerneved -80 ° C.
3. High-density Strain Passende til frembringelse E. coli dobbelte mutanter
- Vokse Hfr donorstammen, idet forespørgslen mutation, markeret med Cm, natten over ved 32 ° C i rigt LB-Cm flydende medium (17 ug / ml Cm) med omrystning ved 220 omdr.lminut.
- Nål bestilte modtager mutant samling i 384-koloni densitet på faste LB plader supplementeret med 50 pg / ml Kan. Parallelt hermed pin donor forespørgslen mutantstamme i 384-koloni densitet på det samme antal LB-plader suppleret med 17 ug / ml Cm. Inkubér pladerne natten over ved 32 ° C.
Note: De modtagende plader, der anvendes til pinning kan kræve op til 36 timer for at opnå tilstrækkeligt store kolonier til efterfølgende trin. Når gennemsnitlige grænse kolonistørrelse er omkring 2 mm i diameter (eller højere), er pladerne klar til at blive fastgjort. - At konjugere stammerne, pin donor fra en 384-koloni natten over donor plade påtil fast LB-plade. Efterfølgende pin en enkelt 384-koloni modtager plade over frisk fastgjort donor på konjugation pladen. Fortsæt med pinning indtil alle donor-modtager-plader er blevet konjugeret ved at fastgøre på faste LB konjugationsmetoder plader. Inkubér fastgjorte konjugering pladerne ved 32 ° C i 16 til 24 timer.
Bemærk: Individuelle enkelt mutant donor stammer kan udvise gen-til-gen variation i parring effektivitet på grund af de mulige virkninger af de mutationer på konjugation, DNA-overførsel effektivitet, eller fitness. Væksten kan stoppes når som helst mellem 16 og 24 timer, når de er tilstrækkeligt store kolonier er blevet opnået for efterfølgende pinning trin. Konjugeringer varede 16 til 24 timer producere tilstrækkeligt antal ex-conjugants for reproducerbare eSGA resultater, selv for mutanterne af forsinket overførsel af gener eller mutanter med lidt lavere fitness. - Pin hver 384-density konjugering plade på en enkelt fast LB-plade, som indeholder Cm (17 ug / ml) og Kan (50ug / ml), indtil alle konjugering plader er fastgjort. Inkuber de frisk-fastgjorte første udvælgelse plader til 16-36 timer ved 32 ° C.
Bemærk: I forhold til udvælgelses trin, kan forskellige mængder af tid være nødvendig for forskellige donorer skærme. Eftersom alle dobbelte mutanter i et givet skærm har samme donor mutation i gennemsnit giver en langsommere voksende donor mutant anledning til langsommere voksende dobbelte mutanter. Således, afhængig af donor fitness, kan selektionstrin kræve mellem 16 og 36 timer. Den dobbelte mutant vækst kan stoppes når de dobbelte mutanter er tilstrækkelig stor til det efterfølgende trin enten pinning efter den første udvælgelse eller billedbehandling efter den anden. Det vil normalt oversætter til grænsekontrol kolonier i gennemsnit med mindst 2 mm diameter. - Re-pin hvert første valg plade på en anden, dobbelt stof (Cm og Kan), udvælgelse plade i 1536-koloni-format, således at hver første udvælgelse koloni er repræsenteret af fire kolonier påden anden udvælgelse plade. Pladerne inkuberes i 16-36 timer ved 32 ° C. Fotografere de endelige dobbeltmutant-udvælgelsesplader til kvantitativ måling af væksten egnethed af mutanten og analysere vekselvirkningerne mellem genpar (figur 3).
Bemærk: Selvom hyppigheden af merodiploidy (partielle kromosomale gentagelser) er lavt med ca 1/1, 000 celler 24, kan merodiploidy maskere GI. Derfor anbefaler vi, herunder biologiske replikerer i alle eSGA skærme. Heldigvis kan kommercielle engangsservice og plast-pinning puder genbruges op til tre gange ved at sterilisere materialer som følger: Agar fra pladerne bortkastes, og pladerne samt puder steriliseres ved at gennemvæde dem i 10% blegemiddel natten over, efterfulgt af en skylning med destilleret vand, vask i 70% ethanol og lufttørring af plastvarer i et flow-bænk under ultraviolet lys. De sterile puder og plader er opbevaret i forseglede sterile plastposer indtil anvendelse.
4. Behandling af data og Udledning GI Scores
- Mål kolonier på hver plade i batch-mode eller individuelt ved hjælp af en specialiseret koloni imaging software 3, 9.
Bemærk: En passende Java-baserede high-throughput koloni billedbehandling og scoring ansøgning er nu frit tilgængelig for offentlig adgang ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). Softwaren fungerer på forskellige platforme (dvs. Mac eller PC) og kan blive lanceret enten som en eksekverbar eller fra en terminal vindue. - Normalisere de rå kolonistørrelse målinger ved at korrigere for systematiske afvigelser inden for og mellem pladerne såsom plade randeffekter, inter-plade variation virkninger, ujævn billede belysning, artefakter på grund af fysisk krumning af agaroverfladen, konkurrence effekter for tilstødende kolonier og mulige pinning defekter , samt forskelle i væksten tid
- Kolonierne i kant rækker og kolonner er ofte større på grund af lavere konkurrence om næringsstoffer end fundet i midten af pladen. Således, at korrigere for denne virkning, skalere størrelsen af kant kolonier at være således, at den gennemsnitlige størrelse i denne række eller kolonne er lig med den gennemsnitlige størrelse af kolonierne i midten af pladen.
- Analysere resultaterne statistisk for at tage hensyn til reproducerbarhed og standard afvigelse fra den mediane størrelse af gentagne koloni målinger. Mindst tre uafhængige biologiske gentagne forsøg er nødvendige for at vurdere den eksperimentelle reproducerbarhed.
- Endelig anvender de normaliserede median kolonivækst fitness størrelser til at generere en GI score (S) for hvert gen par efter følgende formel:
n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Når S var = (var Exp x (n Exp -1) + var Cont x (n Cont -1)) / (n Exp + n Cont -2), var Exp = den maksimale varians af de normaliserede koloni størrelser for dobbelt mutant, var Cont = medianen af variationerne i de normaliserede dobbelte mutant koloni størrelser fra reference sæt, n Exp = antal målinger af dobbelt mutant koloni størrelser, n Cont = det mediane antal forsøgsgentagelser over alle de eksperimenter, μ Exp = median normaliserede koloni størrelser af de dobbelte mutanter, og μ CONT = medianen af normaliserede koloni størrelser til alle dobbelte mutanter som følge af en enkelt donor mutantstamme. S-scoren afspejler både den statistiske pålidelighed af en formodet digenic interaktion samt den biologiske styrken af vekselvirkningen. Stærke positive S-score indikerer afhjælpning effekter, suggesting at de interagerende gener deltager i samme bane 9, mens betydelig negativ S-score afspejler syntetisk sygdom eller dødelighed, som ofte antyder medlemskab i parallelle redundante veje 9. For at bestemme forløb-niveau funktionelle relationer, er en enkelt S-score for hvert par af testede gener fremstillet af det endelige datasæt.
Bemærk: I vores tidligere undersøgelse 9, fandt vi, at rekombination tendens til at forekomme mindre hyppigt mellem gener inden 30 kbp af hinanden. Derfor, for downstream analyse efter normalisering og score generation, fjerner vi interaktioner mellem gener inden 30 kbp af hinanden. Foruden geografiske selv, kan funktionelle relationer mellem par af gener undersøges ved at se på, hvordan lignende GI profiler af de to gener er. GI profil af et gen, er mængden af alle interaktioner af dette gen med alle andre gener i genomet uden forgenets binding område. Funktionelt lignende gener tendens til at have højere korrelationer af genetiske interaktion profiler 12, 25. Ved at beregne korrelationskoefficienter for alle gener i den eksperimentelle datasæt kan man anvende eSGA til undersøgelse af funktionelle relationer selv mellem gener der ligger tæt på hinanden på kromosomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skitseret en trinvis protokol for brug af robot eSGA screening for at undersøge bakterielle genfunktioner på en vej niveau ved forhører GI. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at studere individuelle gener såvel som hele biologiske systemer i E. coli. Omhyggeligt udfører de eksperimentelle ovenfor beskrevne trin, herunder alle passende kontroller, og foretages en gennemgribende analyse og uafhængigt validere GI data er vigtige aspekter for succes eSGA i at gøre nye funktionelle opdagelser. Ud over at eSGA, en begrebsmæssigt lignende metode til at studere GI i E. coli, der betegnes GIANT-coli 17, kan bruges til at belyse nye funktionelle relationer, der ofte savnet af andre tilgange, såsom proteomisk 23 eller fænotypiske 13 skærme alene. Men som med enhver genom tilgang, behøver findes der begrænsninger for anvendeligheden af eSGA eller gigant-coli, for eksempel til andre bakteriearter. Dette kan delvis væreårsagen til manglende adgang til genom-dækkende enkelt gen deletionsmutant stamme kollektioner for de fleste bakteriearter, især for arter, hvor målrettet mutagenese hæmmes af en lav egenfrekvens homolog rekombination. I sådanne tilfælde kan gen forstyrrelser ved hjælp af metoder såsom tilfældige sporbare mutagenese-baserede assays som TnSeq 31 potentielt anvendes til at undersøge bakterielle genfunktioner. For en oversigt over nye alternative bakterielle genetiske screeningsprocedurer, se gennemgang papir ved Gagarinova og Emili (2012) 32.
Selvom GI metoder ofte afslører mange interessante forbindelser, der tyder på nye mekanistiske links, integrering af disse data med andre oplysninger såsom fænotypisk profilering 13, fysisk interaktion netværk 22, 23, og GC-udledte foreninger kan være særligt informativ. For eksempel som med GI netværk, GC foreninger, der er baseret på bevarelsegen orden (operoner), bakterielle genfusioner, operon rekombination frekvenser afledt af intergeniske afstande forudsagte operoner tværs genomer kan såvel som fylogenetisk profilering 33 give yderligere indsigt i, hvordan en bakteriecelle organiserer proteinkomplekser i funktionelle veje til at mægle og koordinere større cellulære processer 12, 23.
E. coli er en arbejdshest model for at forstå den molekylære biologi andre Gram-negative bakterier. Til dette formål kan de eSGA GI data anvendes i forbindelse med sammenligninger genomforskning oplysninger (f.eks fylogenetisk profilering, genekspressionsprofilering) for at undersøge den evolutionære bevarelse af funktionelle relationer opdaget af eSGA tværs andre proteobacterial arter og prokaryote taxa. Desuden er interaktionsdata genereret for E. coli kan anvendes til at opnå indsigt i vejen arkitektur mikrober opdaget af metagenomikrofoner, hvor funktionelle annotationer mangler. Da mange gener er almindeligt konserveret i alle mikrober 23, og fordi antibiotisk følsomhed kan forøges ved visse genetiske perturbationer 34, kan de funktionelle relationer oplyst af eSGA selv potentielt udnyttes til at designe nye kombination lægemiddelterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Genome Canada, Ontario Genomics Institute, og den canadiske Institutes of Health Research tilskud til JG og AE AG er en modtager af Vanier Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065 (2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
- Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
- Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
- Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
- Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
- Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
- Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377 (2011).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
- Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
- Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135 (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
- Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
- Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
- St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).
