Summary
सिस्टमैटिक, बड़े पैमाने पर सिंथेटिक आनुवंशिक (जीन जीन या एपिस्टासिस) बातचीत स्क्रीन आनुवंशिक अतिरेक और क्रॉस - टॉक मार्ग का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम एक उच्च throughput मात्रात्मक सिंथेटिक आनुवंशिक सरणी स्क्रीनिंग तकनीक का वर्णन, eSGA करार दिया है कि हम epistatic रिश्ते elucidating और में आनुवंशिक बातचीत नेटवर्क की खोज करने के लिए विकसित
Protocol
1. 15 Recombineering, 16 HFR कवेली दाता उत्परिवर्ती उपभेदों
eSGA दाता दाग के निर्माण के लिए कदम नीचे वर्णित है. संक्षेप में, हम लक्षित λ का उपयोग करें - लाल प्रवर्धित चयन डीएनए मार्कर कैसेट के मुताबिक़ 16 पुनर्संयोजन टुकड़े पीसीआर द्वारा उत्पन्न करने के लिए गैर जरूरी जीन विलोपन (1.1 अनुभाग) म्यूटेंट या आवश्यक जीन hypomorphic उत्परिवर्ती दाता (1.2 अनुभाग) उपभेदों कि तब के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं बनाने मध्यस्थता 'प्रश्नों सैनिक नेटवर्क को परिभाषित.
नोट: प्रौद्योगिकी के विकास की प्रक्रिया के दौरान, हम एक अच्छी तरह से परिभाषित HFR दाता तनाव (HFR कवेली, HFR Hayes, और HFR 3000) का उपयोग परिवर्तन के संयोजन के लिए HFR की मध्यस्थता conjugative हस्तांतरण का उपयोग कर के प्रभाव का आकलन किया. हम (i) कुशलतापूर्वक दाता recombineering यू एट अल द्वारा बीड़ा उठाया पद्धति का उपयोग करके म्यूटेंट बनाने की क्षमता की जांच की. (2000) 16, (ii) सापेक्ष क्षमताअलग गुणसूत्र मार्करों के conjugative डीएनए हस्तांतरण, और (iii) क्वेरी जीन स्थिति और गुणसूत्र HFR हस्तांतरण बिन्दुपथ, oriT रिश्तेदार उन्मुखीकरण के प्रभाव. हम जानते हैं कि λ पाया - लाल मध्यस्थता मुताबिक़ पुनर्संयोजन दक्षता HFR हेस या Hfr3000 में बहुत से HFR कवेली में अधिक था. यदि आवश्यक हो, P1 पारगमन या एक छद्म HFR 17 तनाव, उत्परिवर्ती दाताओं को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक बनाने और स्क्रीनिंग दाताओं की बड़ी संख्या के लिए इन सभी तरीकों को अनुकूलित किया है. चूंकि हमारे परीक्षण संयुग्मन प्रयोगों में, हस्तांतरण और पूर्व conjugants की संख्या के समग्र दक्षता मनाया काफी HFR कवेली के साथ अधिक से अधिक था, इस विशेष तनाव पृष्ठभूमि दाता निर्माण और बड़े पैमाने पर eSGA के लिए चुना गया था. HFR कवेली दाताओं का उपयोग eSGA स्क्रीन के लिए सभी प्रक्रियाओं का वर्णन कर रहे हैं.
- एक गैर जरूरी जीन को हटाने के बाद recombineering लिए डीएनए टुकड़ा amplifying
दो कदम नेस्टेड पीसीआर ampli रोजगार15:; fication (1 चित्रा) प्लाज्मिड pKD3 से लक्ष्य एक मुख्यमंत्री प्रतिरोध मार्कर के साथ खुला पढ़ने के फ्रेम की जगह के लिए एक जीन विलोपन कैसेट (AAL02033.1 प्रोटीन आईडी 15554330 सैनिक) बनाने के लिए. मार्कर FRT साइटों प्रतिरोध जीन के प्रयोगों का पालन में यदि आवश्यक हो, हटाने की अनुमति 11 द्वारा flanked है.
नोट: हम दो कदम पीसीआर नेस्टेड प्रवर्धित उत्पाद है कि बाद में प्रयोग किया जाता है बैक्टीरियल कोशिकाओं को बदलने से प्लाज्मिड निकालने. प्लाज्मिड हटाना (1 पीसीआर) और फिर 2 पीसीआर में जीन पीटा कैसेट बनाने के लिए आवश्यक है क्योंकि एक प्लाज्मिड के साथ परिवर्तन अधिक recombineering से अधिक कुशल है, और लक्ष्य प्राप्त करने के लिए जितना संभव केवल उपभेदों कि सफलतापूर्वक चयन मार्कर के साथ लक्षित जीनोमिक डीएनए की जगह है. नेस्टेड पीसीआर के लिए एक वैकल्पिक करने के लिए क्षेत्र के प्लाज्मिड बाहर 2 पीसीआर में परिलक्षित प्रतिबंध डाइजेस्ट प्रदर्शनकदम. फिर प्रतिबंध डाइजेस्ट के उत्पाद और शुद्ध नेस्टेड पीसीआर कदम (1.1.2) में एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया. यह विकल्प भी आसान है, लेकिन समय के ऊपर और अधिक काम करने की आवश्यकता है.- आगे F1 और रिवर्स R1 एक 1070 बीपी उत्पाद का उत्पादन प्राइमरों के साथ पीसीआर में एक टेम्पलेट के रूप में के बारे में 45 pKD3 एनजी का प्रयोग करें. पीसीआर क्विएज़न पीसीआर शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग टुकड़ा शुद्ध, और बाँझ आसुत जल में 5 एनजी / μl एकाग्रता उत्पाद जलमिश्रित.
- एक टेम्पलेट के रूप में विशुद्ध पीसीआर उत्पाद का उपयोग करना, जीन विशिष्ट (जैसे पीटा) नेस्टेड प्राइमर F2 और R2, जो 5'-समाप्त हो जाती है (i) जीन विशिष्ट अनुरूपता क्षेत्रों के 45 NT के साथ एक 2 पीसीआर अनुमति देने के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए तुरंत नदी के ऊपर और यह मुख्यमंत्री प्रतिरोध मार्कर (ii) और 3'समाप्त होता है पर 20 NT करने के लिए मुख्यमंत्री मार्कर के संश्लेषण प्रधानमंत्री के साथ बदलने के लिए लक्ष्य जीन के बहाव. उत्पादित टुकड़ा के आकार 1123 बीपी है. जीन विशेष अनुरूपता क्षेत्रों को लक्ष्य सेशन को हटाने के लिए बनाया जाता हैफ्रेम पढ़ने जबकि किसी भी बगल या आंशिक रूप से अतिव्यापी कोडिंग खंडों बरकरार जा एन. इस प्रवर्धन के बाद, 1.3 कदम आगे बढ़ना.
- एक आवश्यक जीन उत्परिवर्तन hypomorphic बनाने के लिए एक टैगिंग कैसेट amplifying
- निर्माण hypomorphic दाता उत्परिवर्ती उपभेदों, एक सी टर्मिनल अनुक्रमिक पेप्टाइड आत्मीयता (एसपीए) संलयन टैग, जो अक्सर थोड़ा destabilizing प्रतिलिपि (यानी प्रोटीन की नकल संख्या) बहुतायत या प्रोटीन तह / गतिविधि से प्रभावों आवश्यक प्रोटीन समारोह जोड़ने. यह अंत करने के लिए, 18 pJL148 में समान nucleotide pJL148 में कान मार्कर flanking दृश्यों और 15 pKD3 में मुख्यमंत्री मार्कर के बीच का उपयोग कर recombineering Cm कान प्रतिरोध मार्कर परिवर्तित द्वारा एक चयन डीएनए SPA टैग टेम्पलेट (एसपीए सेमी) बनाने. परिणामस्वरूप टेम्पलेट फ्रेम में एक सेमी प्रतिरोध मार्कर द्वारा पीछा SPA टैग के होते हैं, और पीसीआर प्रवर्धन, recombineering और बाद में 12 eSGA के लिए उपयुक्त है.
नोट: </ Strong> आवश्यक जीन संभावित जीन समारोह के अध्ययन के लिए सबसे दिलचस्प हैं. हालांकि, क्योंकि इन जीनों को हटाया नहीं जा सकता, अभिनव तरीकों के लिए आवश्यक जीन की कार्यात्मक संबंधों की जांच करने के लिए विकसित किया जा सकता था. कई उपयुक्त बेहद सफल दृष्टिकोण खमीर में शुरू में विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, Davierwala एट अल. (2005) 19 सैनिक प्रदर्शन 575 तापमान के प्रति संवेदनशील आवश्यक जीन म्यूटेंट के एक पैनल का उपयोग कर रहे हैं, और स्क्रीन में पाया गया कि पांच बार nonessential जीनों के रूप में जीआईएस की संख्या के बारे में आवश्यक जीन का प्रदर्शन किया. इसी तरह, Breslow एट अल. 20 (2008) (नम) दृष्टिकोण के लिए hypomorphic ~ आवश्यक खमीर जीन के 82% को कवर करने के लिए रास्ते में और परिसरों के अध्ययन alleles की एक पुस्तकालय उत्पन्न 'mRNA गड़बड़ी से कम बहुतायत' एक विकसित की है. नम दृष्टिकोण व्यक्त mRNA की 3'end को संशोधित लक्ष्य 6 जीन, के कारण होने की संभावना को अस्थिरता mRNA के स्तर को कम करने. नम 6 दृष्टिकोण, हमारी रणनीति के लिए भी इसी तरहy के लिए आवश्यक प्रोटीन व्यक्त mRNA की 3 'अंत perturbing की सूक्ष्म प्रभाव का फायदा उठाने के लिए किया गया है.
जैसा कि हम नीचे का वर्णन है, स्वयं के द्वारा टैग संभावना प्रोटीन तह या समारोह को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन टैग द्वारा mRNA की सूक्ष्म गड़बड़ी के लिए पर्याप्त है, जब पर्यावरण के तनाव या अन्य परिवर्तन के साथ संयुक्त, कार्यात्मक जानकारीपूर्ण जीन 13 पर्यावरण और जीन प्रकट 9-जीन, 12 बातचीत.
सबसे पहले, तिथि करने के लिए, हम SPA-टैग का इस्तेमाल ~ 3000 आवश्यक है और गैर जरूरी ई. कोलाई 21-23 प्रोटीन को शुद्ध 307 ई. कोलाई आवश्यक प्रोटीन हमारे स्पा टैग 8 उपभेदों में प्रतिनिधित्व किया जा रहा है की 80% से अधिक के साथ. क्योंकि टैग सफलतापूर्वक करने के लिए जाना जाता प्रोटीन परिसरों (यानी एक ही परिसर टैगिंग के द्वारा अलग किया जा सकता है और एक ही परिसर के भीतर से अलग प्रोटीन सफ़ाई) जो आपस में मान्य थे को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और अलग परिसरों biologically प्रासंगिक थे, हम कारण है कि टैग करनाप्रोटीन तह या समारोह 12 आम तौर पर प्रभावित नहीं. इसी तरह, हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों से पता चला है कि स्वयं के द्वारा टैग आम तौर पर तनाव के विकास को प्रभावित नहीं करता. हालांकि, हम तर्क है कि टैग और मार्कर कैसेट को एकीकृत 3'-UTR फेरबदल, रूप में नम 6 उपभेदों के लिए सूचना दी थी, शाही सेना के स्तर पर कुछ टेप को अस्थिर या, दुर्लभ अवसरों पर, उचित या तह समारोह में बाधा संलयन प्रोटीन. इसलिए, हम भविष्यवाणी की है कि इस तरह के संयोजन अन्य कार्यात्मक प्रासंगिक परिवर्तन के साथ आवश्यक जीनों के alleles जीनोम में कहीं परेशान जानकारीपूर्ण जीआईएस, जो वास्तव में मनाया गया 12 9 में नतीजा होगा. निकोल्स एट अल द्वारा प्ररूपी प्रोफाइलिंग काम करने के लिए आवश्यक जीन इसके अलावा, स्पा टैग alleles अनुसार जीन पर्यावरण बातचीत (जैसे दवा hypersensitivity) का प्रदर्शन किया. 13 (2011), जो SPA टैग विकास की स्थिति की एक किस्म के लिए आवश्यक उपभेदों के एक सबसेट के अधीन है. इसी अध्ययन confirmeकि घ (58 परीक्षण के बाहर 54) सबसे SPA टैग आवश्यक उपभेदों एक या एक से अधिक संस्कृति 13 शर्तों, जो धारणा है कि SPA टैग अक्सर आवश्यक जीन में हल्के hypomorphic alleles कि जीनोम चौड़ा करने के लिए उपयोगी होते हैं बनाता का समर्थन करता है में बिगड़ा फिटनेस दिखाया सैनिक eSGA सहित स्क्रीन अनुप्रयोगों. - स्पा सेमी मुताबिक़ 5 'अंत में recombineering, (ii) द्वारा पीछा करने के लिए जीन विशेष S1 और S2 प्राइमरों, प्रत्येक युक्त (i) 45 NT के जीन विशिष्ट क्षेत्र का उपयोग टेम्पलेट से टैगिंग कैसेट बढ़ाना एक 27 बीपी SPA 3 'के अंत में मुख्यमंत्री विशिष्ट अनुक्रम.
- निर्माण hypomorphic दाता उत्परिवर्ती उपभेदों, एक सी टर्मिनल अनुक्रमिक पेप्टाइड आत्मीयता (एसपीए) संलयन टैग, जो अक्सर थोड़ा destabilizing प्रतिलिपि (यानी प्रोटीन की नकल संख्या) बहुतायत या प्रोटीन तह / गतिविधि से प्रभावों आवश्यक प्रोटीन समारोह जोड़ने. यह अंत करने के लिए, 18 pJL148 में समान nucleotide pJL148 में कान मार्कर flanking दृश्यों और 15 pKD3 में मुख्यमंत्री मार्कर के बीच का उपयोग कर recombineering Cm कान प्रतिरोध मार्कर परिवर्तित द्वारा एक चयन डीएनए SPA टैग टेम्पलेट (एसपीए सेमी) बनाने. परिणामस्वरूप टेम्पलेट फ्रेम में एक सेमी प्रतिरोध मार्कर द्वारा पीछा SPA टैग के होते हैं, और पीसीआर प्रवर्धन, recombineering और बाद में 12 eSGA के लिए उपयुक्त है.
- अनुरुप और पीसीआर उत्पाद सफ़ाई
- पुष्टि करें कि सही ढंग से टैगिंग कैसेट agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पीसीआर उत्पाद के 2-5 μl subjecting और निर्माता के मानक पीसीआर शुद्धि प्रोटोकॉल (Qiagen) के बाद शेष डीएनए को शुद्ध करके परिलक्षित किया गया था. बाँझ आसुत जल के 30 μl में पीसीआर उत्पाद Elute और ~ 50 एनजी / μl एकाग्रता को पतला. purifiएड उत्पाद परिवर्तन में तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है (1.5 कदम) या उपयोग जब तक 6 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
- दाता निर्माण के लिए HFR कवेली सक्षम कोशिकाओं की तैयारी
- ताजा Luria Bertani एक 250 मिलीलीटर फ्लास्क में 50 ग्राम / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के 35 μl के साथ मध्यम (पौंड) की 70 मिलीलीटर में एक HFR कवेली तनाव के संतृप्त रातोंरात संस्कृति का एक मिलीलीटर टीका लगाना. 32 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) तक 220 आरपीएम पर 600 एनएम का 0.5-0.6 ~ मिलाते प्राप्त (~ 2 घंटा) के साथ संस्कृति सेते हैं.
- Λ लाल पुनर्संयोजन प्रणाली 16 की गर्मी शामिल करने के लिए एक 42 में पानी स्नान ° 160 rpm पर मिलाते हुए साथ 15 मिनट के लिए सी संस्कृति स्थानांतरण. एक ठंडा बर्फ गारा 160 rpm पर 10-20 मिनट के लिए पानी स्नान संस्कृति द्वारा स्थानांतरित प्रेरण बंद करो. उपयोग ट्यूब और cuvettes है कि कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया गया है, के लिए उपयोग करने के लिए पूर्व परिवर्तन के बाद जब तक इस बात से कोशिकाओं को ठंडा रखने के लिए सुनिश्चित करें.
- ग फूट डालो2 पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब (~ 35 ट्यूब प्रति मिलीलीटर संस्कृति) और 4 में 6 मिनट के लिए 4400 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस में समान रूप से ulture
- तैरनेवाला त्यागें, और फिर से स्थगित में कोमल उलटा द्वारा सेल गोली ~ ठंडा बाँझ आसुत पानी की 50 मिलीलीटर. कोशिकाओं को फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 4400 XG पर अपकेंद्रित्र तैरनेवाला त्यागें और फिर से प्रत्येक कोशिका को निलंबित गोली ठंडा बाँझ 10% ग्लिसरॉल के 20 मिलीलीटर में और फिर अपकेंद्रित्र के रूप में ऊपर वर्णित है.
- तैरनेवाला छानना और ठंडा 10% ग्लिसरॉल के 500 μl में सेल गोली पुनः को निलंबित. व्यक्ति, पूर्व ठंडा तत्काल परिवर्तन के लिए 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में 50 μl मात्रा में तैयार सक्षम कोशिकाओं अशेष भाजक. कोशिकाओं सूखी बर्फ पर या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 3 महीने के लिए. हालांकि, परिवर्तन दक्षता हौसले से तैयार सक्षम कोशिकाओं के साथ सबसे अधिक है.
- परिवर्तन
- शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 100 एनजी से जोड़ेंसक्षम कोशिकाओं को 1.3.1 कदम. ट्यूब झाड़ और निलंबन के लिए 5 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक पूर्व ठंडा electroporation क्युवेट ठंडा सक्षम कोशिकाओं और डीएनए के निलंबन स्थानांतरण. 2.5 केवी, 25 μF, 200 ohms एक 2 मिमी की खाई को क्युवेट में स्थापित के साथ सेल मिश्रण Electroporate (यानी अगर एक अलग क्युवेट का उपयोग कर, electroporation सेटिंग्स के लिए निर्माता के निर्देशों को देखने), और तुरंत कमरे के तापमान समाज माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 220 rpm पर मिलाते कक्षीय के साथ 1 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब और सेते में समाज मध्यम में electroporated कोशिकाओं स्थानांतरण.
- ऊष्मायन के बाद, ४४०० XG में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला के लगभग 850 μl निकालें, और शेष तरल में सेल गोली पुनः को निलंबित.
- पूर्व गर्म लेग प्लेट 32 ° रातोंरात सी में 17 ग्राम / मिलीलीटर Cm, और सेते युक्त कोशिकाओं पर बिखरा हुआ है. लेग पर बाहर दो व्यक्ति transformant कालोनियों और लकीर उठाओसेमी उत्परिवर्ती पुष्टि के लिए प्लेटें. तो हम सबसे बड़ा transformant कालोनियों से परहेज करने की अनुशंसा क्रम में दुर्लभ शमन परिवर्तन के साथ उपभेदों उठा की संभावना को कम करने के. इसके अलावा लेग कान पर एक ही लकीर transformants पुष्टि करने के लिए कि उपभेदों कान प्रतिरोधी नहीं हैं.
नोट: चूंकि मुख्यमंत्री प्रतिरोध मार्कर दाता उपभेदों बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो हम दाता म्यूटेंट कान प्रतिरोधी होने की उम्मीद नहीं करते हैं. दोनों लेग कान और लेग सेमी की प्लेटों पर transformants streaking करके, हम यह सुनिश्चित करना है कि दाता उत्परिवर्तन ही किसी भी तरह कान प्रतिरोध का कारण नहीं था. यदि यह कदम प्रदर्शन नहीं है और लक्ष्य परिवर्तन तनाव कान पर जीवित रहने की क्षमता को प्रभावित कर रहे थे, डबल म्यूटेंट प्रभावी ढंग से eSGA का उपयोग कर के बाद से दाता उपभेदों सभी चयन कदम बच जाएगा नहीं बनाया जाएगा. यह महज एक एहतियाती तार्किक कदम अप्रत्याशित phenotypes या किसी भी अन्य मुद्दों कि eSGA स्क्रीन के पूरा होने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं पकड़ने है. यदि इस कदम को छोड़ दिया गया है, अन्य नियंत्रण woulअभी भी असफल स्क्रीन की पहचान चाहते हैं. हालांकि, एक दाता है कि कान के लिए प्रतिरोधी है एक पहले पता लगाने अनुत्पादक और अनावश्यक कदम की एक श्रृंखला को समाप्त होगा. एक कान पर विकसित करने के लिए तनाव उदाहरण के लिए शामिल हो सकते हैं के लिए अन्य संभावित कारण एक गलत पीसीआर उत्पाद या परिवर्तन के लिए एक तनाव का उपयोग के रूप में एंटीबायोटिक के रूप में अच्छी तरह से समाप्त हो गई है. इन सभी मुद्दों पर और पहचाना जा सकता है पर जल्दी से इस पर नियंत्रण है, जो की आवश्यकता नहीं है की सहायता के साथ प्रक्रिया में निपटा है, लेकिन लिए सिफारिश की eSGA.
- गैर जरूरी जीन (1.6.1 कदम) को हटाने या आवश्यक जीन hypomorphic उत्परिवर्तन (1.6.2 अनुभाग) की पुष्टि
नोट: जब पीसीआर द्वारा जीन विलोपन की पुष्टि, एक जंगली प्रकार के तनाव से जीनोमिक डीएनए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.- गैर जरूरी जीन विलोपन की पुष्टि
- पीसीआर द्वारा जीन हटाए जाने की पुष्टि करने के लिए, बदल, ख्यात पीटा तरल माध्यम पौंड सेमी में हो उपभेदों से manufact बाद जीनोमिक डीएनए को अलगurer निर्देश (PROMEGA).
- सफल recombineering की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक transformant से पीटकर पुष्टि प्राइमरों के तीन अलग अलग सेट के साथ डीएनए बढ़ाना. ~ जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट के 150 एनजी के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, और एक agarose जेल पर पीसीआर संश्लेषित उत्पादों को चलाने के द्वारा सही टुकड़ा आकार की पुष्टि.
- 1 प्राइमर सेट 20-NT के flanking किताब, लक्षित क्षेत्र के (KOCO एफ) के 200 बीपी अपस्ट्रीम में स्थित है, और सेमी आर प्राइमर जो मुख्यमंत्री कैसेट अनुक्रम पूरक है के होते हैं. इस प्रवर्धन के लिए एक 445 उत्परिवर्ती में NT amplicon उपज है, लेकिन नहीं जंगली प्रकार तनाव (1 चित्रा) में होने की उम्मीद है.
- 2 सेट (सेमी - एफ) एक आगे प्राइमर, मुख्यमंत्री कैसेट अनुक्रम annealing, और एक 20-NT पुष्टि प्राइमर flanking रिवर्स (KOCO नि.), जो की 3 'अंत के 200 बीपी अनुप्रवाह तपाना करने के लिए बनाया गया है शामिल जीन को हटा दिया है. यह प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए एक 309 उत्परिवर्ती में NT amplicon का उत्पादन होने की उम्मीद है, लेकिन कोईजंगली प्रकार के तनाव में टी (1 चित्रा).
- 3 पीसीआर KOCO एफ और KOCO-R प्राइमरों शामिल हैं. इस प्रतिक्रिया के लिए पुष्टि की आवश्यकता है कि चयनित है तनाव एक merodiploid नहीं है के साथ एक जीन बिन्दुपथ कैसेट द्वारा प्रतिस्थापित किया गया होने और एक अन्य दोहराया लेकिन अन्यथा जीन की नकल जंगली प्रकार अभी भी मौजूद है. एक सही विलोपन उत्परिवर्ती से यह प्रवर्धन के लिए एक 1.4 केबी उत्पाद (1 चित्रा) उत्पादन की उम्मीद है.
नोट: जब लक्ष्य जीन जीन विलोपन कैसेट के रूप में बेस जोड़े में एक ही लंबाई के बारे में है, एक एक ठिकाना है जो कैसेट द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, और एक ठिकाना है नहीं जो के बीच एक अंतर नोटिस नहीं होगा. ऐसे मामलों में एक निश्चित पुष्टि के लिए, हम अतिरिक्त प्राइमरों का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से नष्ट कर दिया जीन के भीतर एक डीएनए खंड बढ़ाना करने की सलाह देते हैं. इस मामले में, अगर जीन हटा दिया गया है, एक प्रवर्धन उत्पाद जंगली प्रकार नियंत्रण तनाव में ही है और उत्परिवर्ती में नहीं मनाया जाएगा. इन प्राइमरोंमैन्युअल रूप से हो सकता है या computationally करने के लिए विशेष रूप से हटाए गए क्षेत्र के भीतर डीएनए के एक खंड बढ़ाना बनाया. हम आम तौर पर 140 बीपी क्षेत्रों बढ़ाना.
- आवश्यक जीन hypomorphic उत्परिवर्तन की पुष्टि
- के पीसीआर द्वारा hypomorphic उत्परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए, जीन विशिष्ट 20-NT (KOCO एफ) आगे और रिवर्स (KOCO नि.) 200 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम स्थित प्राइमरों, क्रमशः SPA टैग प्रविष्टि साइट (चित्रा 2) का उपयोग करें.
नोट: यह प्रवर्धन कदम एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है लक्ष्य आवश्यक जीन की एक untagged प्रतिलिपि के अभाव सुनिश्चित करने. जब केवल एक टैग संस्करण मौजूद है, एक एकल बैंड 310 amplicon स्पा सेमी से भी बड़ा बीपी मनाया जाता है. एक 400 बीपी उत्पाद जीन की untagged संस्करण की उपस्थिति का संकेत होगा. - पीसीआर की पुष्टि करने के लिए समानांतर में, पश्चिमी SPA-टैग के फ्रेम में प्रविष्टि को सत्यापित करने के लिए सोख्ता एक विरोधी झंडा M2 सपा का ध्वज epitopes विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग का उपयोग21 टैग.
- के पीसीआर द्वारा hypomorphic उत्परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए, जीन विशिष्ट 20-NT (KOCO एफ) आगे और रिवर्स (KOCO नि.) 200 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम स्थित प्राइमरों, क्रमशः SPA टैग प्रविष्टि साइट (चित्रा 2) का उपयोग करें.
- गैर जरूरी जीन विलोपन की पुष्टि
- भंडारण दाता तनाव की पुष्टि की
- लेबल cryovials की पुष्टि की रीकॉम्बीनैंट दाता उत्परिवर्ती तनाव के रातोंरात संस्कृति स्थानांतरण, 15% अंतिम एकाग्रता ग्लिसरॉल के साथ पूरक है, और अच्छी तरह से मिश्रण. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 में cryovials रखने के लिए डिग्री सेल्सियस
2. ई. arraying कोलाई eSGA स्क्रीन के लिए एफ - प्राप्तकर्ता म्यूटेंट
- प्रतिकृति पिन ई. कोलाई कीयो एकल जीन गैर जरूरी विलोपन उत्परिवर्ती मोरी एट अल द्वारा उत्पन्न संग्रह (3968 11 उपभेदों, एफ BW25113; ओपन Biosystems से प्राप्त किया जा सकता है) robotically चौबीस 384 अच्छी तरह से अच्छी तरह से के प्रति तरल लेग मीडिया के 80 μl युक्त microplates , 50 ग्राम / मिलीलीटर Kan. साथ पूरक
नोट: व्यवस्थित आवश्यक जीन के साथ जीआईएस का आकलन करने के लिए, प्राप्तकर्ता कीयो संग्रह 11 F-कान चिह्नित आवश्यक जीन hypomorph के साथ पूरक किया जा सकता हैसी टर्मिनल 22 SPA टैग के साथ आईसी उत्परिवर्ती उपभेदों, 23. - सीमा नियंत्रण तनाव, जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा के लिए जगह बनाने, भीतर और प्लेट normalizations के बीच के रूप में अच्छी तरह से रूप में स्वचालित कॉलोनी quantizations में सहायता, एक थाली के बाह्यतम कुओं से ऊपर कदम और हस्तांतरण से inoculated मीडिया को दूर नई प्लेटों, फिर बाह्यतम कुओं खाली छोड़.
नोट: कीयो संग्रह 11 से सीमा नियंत्रण JW5028 तनाव एक छोटे छद्म जीन है, और नहीं हमारे पूरे जीनोम स्क्रीन में किया गया है, किसी भी दाताओं के साथ जीआईएस प्रदर्शन के लिए हटा दिया गया है. इसलिए, यह एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण के लिए दुर्लभ मामलों की पहचान विकार, लगाए चयन करें, या विफल रहे हैं, अनुपस्थित या छिटपुट सीमा तनाव विकास में जिसके परिणामस्वरूप तनाव है. उदाहरण के लिए, अगर सीमा नियंत्रण कालोनियों दोहरे उत्परिवर्ती चयन के बाद जाना नहीं है, क्वेरी तनाव विकार में सक्षम नहीं हो सकता है, मैं संयुग्मन किया गया है करने का प्रयास हो सकता हैना शर्त है कि यह जगह (एक एंटीबायोटिक युक्त थाली पर जैसे), या एक गलत एंटीबायोटिक लेने से रोका चयन थाली करने के लिए जोड़ दिया गया हो सकता है. इसी तरह, अगर बहुत कुछ है, छिटपुट कालोनियों सीमा सहित पूरी थाली, पर मनाया जाता है, विकार या pinning और विफल रहे हो सकता है स्क्रीन करने के लिए दोहराया जाना चाहिए. यदि इस छिटपुट सीमा वृद्धि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, यह लगातार गरीब दाता विकार से संकेत मिलता है और इस प्रकार उदाहरण हैं जहां डबल म्यूटेंट नहीं मनाया जाता है संभवतः विकार, सच जीआईएस नहीं विफलता के कारण हो सकता है. इस तरह के स्क्रीन के लिए आगे के विश्लेषण से खारिज किया जा आवश्यकता होगी. इसके अलावा, सभी प्लेटों पर मौजूद होने के द्वारा, सीमा नियंत्रण तनाव कॉलोनी परिमाणीकरण सॉफ्टवेयर स्वतः दोहरे उत्परिवर्ती प्लेटें और इस तरह कॉलोनी पदों के लिए मैन्युअल सीमांकन होना जरूरी नहीं है पर कॉलोनी की स्थिति निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. अन्त में, सीमा नियंत्रण के भीतर कॉलोनी आकार के सामान्यीकरण में तनाव एड्स (जैसे एक थाली के भीतर अलग पंक्तियों) और between प्लेटों (जैसे विभिन्न प्राप्तकर्ता प्लेटों को अलग - अलग समय पर एक ही दाता के साथ टिकी). - इसी तरह, एक प्लेट के भीतर एक अलग स्थान नहीं है (सीमा) से किसी भी दो उपभेदों हटाने के द्वारा नकारात्मक नियंत्रण स्पॉट बनाने के लिए और एक नई प्लेट उपभेदों स्थानांतरण. लेग 17 ग्राम / सेमी मिलीलीटर वाले मीडिया के साथ इन खाली कुओं भरें. इन नकारात्मक नियंत्रण स्पॉट प्राप्तकर्ता और इसलिए डबल उत्परिवर्ती प्लेटों में खाली हो सकता है और सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई प्रोसेसिंग या थाली से निपटने त्रुटियों था जब क्रमांकन, इमेजिंग, या प्लेटों लगाए मदद की उम्मीद कर रहे हैं.
नोट: इन खाली स्थानों नकारात्मक नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं. नकारात्मक नियंत्रण उदाहरण पहचान जब चयन विफल रहता है - जब नकारात्मक नियंत्रण उपभेदों चयन के दौरान बढ़ने में मदद. हम न केवल प्राप्तकर्ता प्लेटों के प्रत्येक के लिए अद्वितीय नकारात्मक नियंत्रण स्पॉट का चयन करने के लिए, लेकिन यह भी थाली के एक ही वृत्त का चतुर्थ भाग के भीतर नकारात्मक नियंत्रण धब्बे (उदाहरण के लिए निचले सही) चुनने का सुझाव देते हैं. इस तरह, पैटर्ननकारात्मक नियंत्रण स्पॉट के संभव प्लेट mishandling त्रुटियों (जैसे प्लेटें mislabeled किया जा रहा है या किया जा रहा है उल्टा टिकी है, जहां और ऊपरी बाएँ कॉलोनी कम सही स्थिति में टिकी है) की पहचान करेगा. - कीयो तनाव JW5028 11 टीका लगाना, एक pseudogene विलोपन के साथ, एक 200 मिलीलीटर लेग साथ 500 मिलीलीटर फ्लास्क में, 50 ग्राम / Kan. मिलीलीटर के आधार पर हमारे पूरे जीनोम eSGA स्क्रीन युक्त, इस विशेष उत्परिवर्ती विकास जंगली करने के लिए करीब है BW25113 प्रकार और यह इस प्रकार एक सीमा नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
- 600 एनएम पर 0.6 - arrayed के रूप में के रूप में अच्छी तरह से JW5028 संस्कृति उपभेदों 32 में रातोंरात ° 190 rpm कक्षीय साथ सी 0.4 ~ के एक आयुध डिपो को मिलाते हुए आगे बढ़ें. रातोंरात के विकास के बाद, JW5028 रातोंरात संस्कृति का लगभग 80 μl के साथ सीमा कुओं में भरने के लिए.
- इकट्ठे प्लेटें 3.2 चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 15% ग्लिसरॉल के साथ प्राप्तकर्ता प्लेटों में हर अच्छी तरह से पूरक, मीडिया और ग्लिसरॉल मिश्रण, और प्लेट रखना-80 डिग्री सेल्सियस
3. उच्च घनत्व ई. पैदा करने के लिए तनाव संभोग प्रक्रिया कोलाई डबल म्यूटेंट
- बढ़ो HFR दाता तनाव है, क्वेरी उत्परिवर्तन का असर, सेमी, 32 पर रात भर ° अमीर तरल पौंड सेमी मध्यम में सी 220 rpm पर मिलाते हुए के साथ (17 / ग्राम सेमी मिलीलीटर) के साथ चिह्नित.
- ठोस लेग समानांतर में 50 / छ Kan. मिलीलीटर के साथ पूरक प्लेटों पर 384 कॉलोनी घनत्व में आदेश प्राप्तकर्ता उत्परिवर्ती संग्रह पिन, लेग प्लेटों के एक ही नंबर पर दाता क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव 384 कॉलोनी घनत्व में पिन, 17 ग्राम के साथ पूरक Cm / एमएल. 32 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें रातोंरात सेते
नोट: प्राप्तकर्ता pinning के लिए प्रयोग किया जाता प्लेटों बाद के चरणों के लिए पर्याप्त रूप से बड़े कालोनियों को प्राप्त करने के लिए 36 घंटे के लिए की आवश्यकता हो सकती है. जब औसत सीमा कॉलोनी आकार व्यास में 2 मिमी (या अधिक) के बारे में है, प्लेटें टिकी हो करने के लिए तैयार कर रहे हैं. - उपभेदों संयुग्म, एक 384 कॉलोनी रातोंरात दाता पर थाली से दाता पिनठोस लेग थाली. इसके बाद विकार की थाली पर हौसले से टिकी दाता पर एक एकल प्राप्तकर्ता 384 कॉलोनी थाली पिन. लगाए जारी रखें जब तक सभी दाता प्राप्तकर्ता प्लेटें ठोस लेग संयुग्मन प्लेटों पर लगाए द्वारा संयुग्मित किया गया है. 32 डिग्री सेल्सियस पर 16 से 24 घंटे के लिए टिकी विकार प्लेटों सेते हैं.
नोट: व्यक्तिगत एकल उत्परिवर्ती दाता उपभेदों विकार पर परिवर्तन, डीएनए स्थानांतरण क्षमता या रखरखाव के संभावित प्रभाव की वजह से जीन जीन संभोग दक्षता में परिवर्तनशीलता दिखा सकते हैं. ग्रोथ 16 और 24 घंटे, जब पर्याप्त बड़ी कालोनियों बाद लगाए कदम के लिए प्राप्त किया गया है के बीच किसी भी समय पर रोका जा सकता है. 24 घंटे के लिए 16 स्थायी conjugations भी थोड़ा कम फिटनेस के साथ देर से स्थानांतरित करने जीन या म्यूटेंट म्यूटेंट के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य eSGA परिणाम के लिए पूर्व conjugants की पर्याप्त संख्या का उत्पादन. - एक ठोस लेग प्लेट, जिसमें सेमी (17 ग्राम / एमएल) और कान (50 पर प्रत्येक 384 विकार घनत्व प्लेट पिन/ जब तक सभी संयुग्मन प्लेटें ग्राम मिलीलीटर) टिकी किया गया है. 32 डिग्री सेल्सियस पर हौसले से टिकी 16-36 घंटे के लिए पहले चयन प्लेटें सेते
नोट: चयन कदम के लिए संबंध है, समय के विभिन्न राशियों अलग दाता स्क्रीन के लिए आवश्यक हो सकता है. के बाद से एक भी स्क्रीन में सभी डबल म्यूटेंट ही दाता उत्परिवर्तन है, औसत पर, एक धीमी बढ़ती दाता उत्परिवर्ती धीमी बढ़ती डबल म्यूटेंट को जन्म देता है. इस प्रकार, दाता फिटनेस पर निर्भर करता है, चयन चरणों का 16 और 36 घंटे के बीच की आवश्यकता हो सकती है. जब डबल म्यूटेंट बाद कदम या तो 1 या 2 के बाद चयन इमेजिंग के बाद लगाए के लिए पर्याप्त रूप से बड़े हैं दोहरे उत्परिवर्ती विकास रोका जा सकता है. यह आमतौर पर करने के लिए कम से कम 2 मिमी diameters के साथ औसत पर नियंत्रण कालोनियों सीमा अनुवाद है. - प्रत्येक 1 चयन प्लेट एक दूसरे, डबल (सेमी और कान) दवा, चयन प्लेट पर 1536 कॉलोनी प्रारूप में पुनः पिन है कि इस तरह के प्रत्येक 1 चयन कॉलोनी पर चार कालोनियों के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है2 चयन प्लेट. 32 डिग्री सेल्सियस पर 16-36 घंटे के लिए प्लेटें सेते अंतिम डबल उत्परिवर्ती चयन प्लेटें तस्वीर मात्रात्मक विकास की फिटनेस उत्परिवर्ती मापने के लिए और जीन जोड़े (चित्रा 3) के बीच बातचीत का विश्लेषण.
नोट: हालांकि (आंशिक गुणसूत्र duplications) merodiploidy की आवृत्ति के बारे में 1/1, 000 24 कोशिकाओं को कम है, merodiploidy सैनिक मुखौटा कर सकते हैं. इसलिए, हम सभी eSGA स्क्रीन में जैविक replicates सहित सलाह देते हैं. सौभाग्य से, वाणिज्यिक डिस्पोजेबल प्लेटों और प्लास्टिक लगाए पैड तीन गुना किया जा reused किया जा सकता है के रूप में सामग्री स्टरलाइज़ द्वारा: अग्रवाल प्लेटों से खारिज कर दिया है और एक से प्लेटों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पैड 10% ब्लीच में उन्हें रातोंरात भिगोने के द्वारा निष्फल रहे हैं, पीछा आसुत पानी से कुल्ला, 70% इथेनॉल में कपड़े धोने, और पराबैंगनी प्रकाश के तहत एक प्रवाह हुड में plasticware हवा सुखाने. बाँझ पैड और प्लेटें उपयोग जब तक सील बाँझ प्लास्टिक की थैलियों में संग्रहीत हैं.
4. डाटा प्रोसेसिंग और सैनिक स्कोर पाने
- बैच मोड में एक थाली पर कालोनियों को मापने या व्यक्तिगत रूप से एक विशेष कॉलोनी इमेजिंग 3 सॉफ्टवेयर, 9 का उपयोग कर.
नोट: उपयुक्त जावा आधारित कॉलोनी उच्च throughput इमेजिंग और स्कोरिंग आवेदन अब स्वतंत्र रूप से सार्वजनिक उपयोग के लिए (उपलब्ध http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ) है . सॉफ्टवेयर विभिन्न प्लेटफार्मों (यानी मैक या पीसी) पर काम करता है और या तो एक निष्पादन योग्य के रूप में या एक टर्मिनल विंडो से शुरू किया जा सकता है. - भीतर और प्लेट बढ़त प्रभाव, अंतर - प्लेट भिन्नता प्रभाव, असमान छवि प्रकाश, अगर सतह की शारीरिक वक्रता की वजह से कलाकृतियों, पड़ोसी कालोनियों के लिए प्रतियोगिता के प्रभाव और संभव लगाए दोष के रूप में प्लेटों के बीच व्यवस्थित biases को सही करने के लिए कच्चे कॉलोनी आकार माप सामान्यकरें , के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास के समय में मतभेद
- बढ़त पंक्तियों और स्तंभों में कालोनियों से प्लेट के केंद्र में पाया पोषक तत्वों के लिए कम प्रतिस्पर्धा के कारण बड़े हो जाते हैं. इस प्रकार, इस आशय के लिए सही है, पैमाने बढ़त कालोनियों के आकार ऐसी है कि उस पंक्ति या स्तंभ में औसत आकार प्लेट के केंद्र में कालोनियों के औसत आकार के बराबर है.
- परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए खाते में और दोहराने कॉलोनी माप की औसत आकार से मानक विचरण reproducibility ले. कम से कम तीन स्वतंत्र जैविक दोहराने प्रयोगों प्रयोगात्मक reproducibility का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं.
- अंत में, सामान्यीकृत मंझला कॉलोनी विकास फिटनेस आकार का उपयोग करने के लिए प्रत्येक जीन निम्न सूत्र का उपयोग जोड़ी के लिए एक सैनिक स्कोर (एस) उत्पन्न:
n 1 "src =" files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg / "/>
कहाँ, एस var = (var ऍक्स्प x (एन -1 ऍक्स्प) + var Cont (n Cont -1) x) / (n ऍक्स्प + n Cont -2); var ऍक्स्प = सामान्यीकृत कॉलोनी आकार की अधिकतम विचरण के लिए , सामान्यीकृत डबल संदर्भ सेट से उत्परिवर्ती कॉलोनी आकार में variances के डबल उत्परिवर्ती var Cont = मंझला, n ऍक्स्प दोहरे उत्परिवर्ती कॉलोनी आकार के माप की संख्या, n Cont = प्रयोगात्मक की औसत संख्या सभी प्रयोगों पर replicates, μ ऍक्स्प = मंझला डबल म्यूटेंट के सामान्यीकृत कॉलोनी आकार, और μ Cont = एक दाता उत्परिवर्ती तनाव से उत्पन्न होने वाले सभी डबल म्यूटेंट के लिए सामान्यीकृत कॉलोनी आकार के बीच का है. एस स्कोर दोनों एक ख्यात digenic बातचीत के सांख्यिकीय विश्वास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बातचीत की जैविक शक्ति को दर्शाता है. मजबूत सकारात्मक एस स्कोर को समाप्त प्रभाव, संकेत मिलता हैuggesting कि बातचीत जीन ही 9 मार्ग में भाग लेते हैं, जबकि नकारात्मक एस स्कोर महत्वपूर्ण सिंथेटिक बीमारी या मारक है, जो अक्सर समानांतर निरर्थक 9 रास्ते में सदस्यता का सूचक को प्रतिबिंबित. मार्ग स्तर कार्यात्मक संबंध का निर्धारण करने के लिए, एक परीक्षण जीनों के प्रत्येक जोड़ी के लिए एस स्कोर अंतिम डाटासेट से उत्पादन किया है.
नोट: हमारे पिछले 9 अध्ययन में हमने पाया कि पुनर्संयोजन के जीन के बीच एक दूसरे के 30 KBP भीतर अक्सर कम हो जाता है. इसलिए, बहाव के विश्लेषण के लिए, सामान्य और स्कोर पीढ़ी के बाद, हम एक दूसरे के 30 KBP भीतर जीन के बीच बातचीत को हटा दें. खुद जीआईएस के अलावा, जीन के जोड़े के बीच कार्यात्मक संबंध कैसे इसी तरह दो जीन सैनिक प्रोफाइल देख कर जांच की जा सकती है. एक जीन की सैनिक प्रोफाइल के बाहर जीनोम में अन्य सभी जीन के साथ कि जीन की सभी बातचीत के सेट हैजीन के संबंध क्षेत्र. कार्यात्मक इसी तरह के जीन आनुवंशिक बातचीत 12 प्रोफाइल, 25 के उच्च correlations हो जाते हैं. इस प्रकार, एक जीन गुणसूत्र पर एक दूसरे के करीब झूठ बोल के बीच भी कार्यात्मक संबंधों की जांच के लिए प्रयोगात्मक डेटासेट में सभी जीनों के लिए सहसंबंध गुणांक की गणना eSGA का उपयोग कर सकते हैं.
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Discussion
हम रोबोट eSGA स्क्रीनिंग का उपयोग करने के लिए पूछताछ सैनिक द्वारा एक मार्ग स्तर पर बैक्टीरिया का जीन कार्यों की जांच करने के लिए एक कदम वार प्रोटोकॉल रेखांकित किया है. इस दृष्टिकोण ई. में व्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीन पूरे जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कोलाई. ध्यान प्रयोगात्मक ऊपर वर्णित सभी उचित नियंत्रण सहित कदम, को क्रियान्वित करने, और कड़ाई से विश्लेषण और स्वतंत्र रूप से मान्य सैनिक डेटा नए कार्यात्मक खोजों बनाने में eSGA की सफलता के लिए महत्वपूर्ण पहलू हैं. ESGA, ई. में सैनिक का अध्ययन करने के लिए एक अवधारणात्मक रूप से समान विधि के अलावा कोली, 17 विशाल - कोलाई करार दिया, उपन्यास कार्यात्मक संबंध है कि अक्सर 23 प्रोटिओमिक या अकेले प्ररूपी 13 स्क्रीन के रूप में अन्य दृष्टिकोण, से याद कर रहे हैं रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, किसी भी जीनोम चौड़ा दृष्टिकोण के साथ, सीमाओं eSGA या विशाल - कोलाई की प्रयोज्यता पर मौजूद नहीं है, उदाहरण के लिए अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों. यह आंशिक रूप से किया जा रहा हैसबसे बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए जीनोम चौड़ा एक जीन विलोपन उत्परिवर्ती तनाव संग्रह की अनुपलब्धता की प्रजातियों जहां लक्षित mutagenesis के मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक कम प्राकृतिक आवृत्ति द्वारा रुकावट है के लिए विशेष रूप से, कारण. ऐसे मामलों में, जीन अवरोधों यादृच्छिक 31 TnSeq तरह trackable mutagenesis आधारित assays के रूप में इस तरह के तरीकों का उपयोग कर संभवतः बैक्टीरियल जीन कार्यों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उभरते वैकल्पिक बैक्टीरियल आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन के लिए, Gagarinova और Emili (2012) 32 के द्वारा समीक्षा कागज देख.
हालांकि सैनिक तरीकों अक्सर कई दिलचस्प कनेक्शन प्रकट उपन्यास यंत्रवत लिंक, प्ररूपी की रूपरेखा 13, शारीरिक बातचीत नेटवर्क 22, 23, और जीसी - inferred संघों के रूप में अन्य जानकारी के साथ इन आंकड़ों के एकीकरण की विचारोत्तेजक विशेष रूप से जानकारीपूर्ण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, सैनिक नेटवर्क, जीसी संघों, जो संरक्षण के आधार पर कर रहे हैं के साथ के रूप मेंजीन आदेश (operons), बैक्टीरियल जीन fusions, operon पुनर्संयोजन आवृत्तियों जीनोम भर में भविष्यवाणी की operons के intergenic दूरी से व्युत्पन्न, के रूप में वंशावली 33 की रूपरेखा के रूप में अच्छी तरह से कैसे एक जीवाणु सेल कार्यात्मक रास्ते में प्रोटीन परिसरों का आयोजन के लिए मध्यस्थता और प्रमुख समन्वय में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं सेलुलर प्रक्रियाओं 12, 23.
ई. कोलाई अन्य ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं की आणविक जीव विज्ञान को समझने के लिए एक workhorse मॉडल है. यह अंत करने के लिए, eSGA सैनिक डेटा तुलनात्मक जीनोमिक्स जानकारी के लिए (जैसे वंशावली रूपरेखा, जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा) कार्यात्मक अन्य proteobacterial प्रजातियों भर eSGA द्वारा की खोज रिश्ते और prokaryotic taxa की विकासवादी संरक्षण की जांच के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, बातचीत डेटा ई. के लिए उत्पन्न कोलाई रोगाणुओं के मार्ग वास्तुकला metageno द्वारा खोज में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैmics, जो के लिए कार्यात्मक एनोटेशन कमी कर रहे हैं. चूंकि कई जीनों व्यापक रूप से सभी 23 रोगाणुओं में संरक्षित कर रहे हैं, और है क्योंकि एंटीबायोटिक संवेदनशीलता कुछ आनुवंशिक 34 perturbations से बढ़ाया जा सकता है, कार्यात्मक eSGA द्वारा प्रबुद्ध रिश्तों भी संभावित अभिनव संयोजन दवा के उपचारों के डिजाइन के लिए शोषण किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के जीनोम कनाडा, ओंटारियो जीनोमिक्स संस्थान और स्वास्थ्य JG और AE एजी अनुसंधान अनुदान की कनाडा के संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया Vanier कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
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