Protein felveckning cyklisk förstärkning (PMCA) är en in vitro-analys för att studera prioner konvertering och påfrestningar och arter hinder. Den kan också användas som en prion detektionsanalys.
Prioner är smittämnen som orsakar oundvikligen dödlig transmissibel spongiform encefalopati (TSE) hos djur och människor 9,18. Prionproteinet har två distinkta isoformer, icke-infektiösa värd-kodade proteinet (PrP ^) och infektiöst protein (PrP ^), en onormalt vikta isoformen av PrP ^ 8.
En av utmaningarna med att arbeta med prion medel är den långa inkubationstiden före utvecklingen av kliniska tecken efter värd ympning 13. Detta uppdrag traditionellt långa och dyra djurförsök bioassay. Dessutom är de biokemiska och biofysiska egenskaper hos PrP dåligt karakteriseras på grund av deras ovanliga konformation och aggregering stater.
PrP kan utsäde omvandlingen av PrP ^ till PrP ^ in vitro 14. PMCA är en in vitro-teknik som tar Advantage av denna förmåga med hjälp sonikering och inkubering cykler för att producera stora mängder PrP ^, i en ökande takt, från ett system innehållande överskottsmängder av PrP ^ och små mängder av PrP Sc frö 19. Denna teknik har visat sig effektivt rekapitulera art och stam specificitet PrP omvandling från PrP ^, för att emulera interferens prionstam, och för att förstärka mycket låga nivåer av PrP från infekterade vävnader, vätskor, och miljöprover 6,7,16, 23.
Detta dokument specificerar PMCA protokoll, inklusive rekommendationer för att minimera kontaminering, genererar konsekventa resultat och kvantifiera dessa resultat. Vi diskuterar också flera PMCA program, inklusive produktion och karakterisering av smittsamma prion stammar, prionstam störningar samt upptäckt av prioner i miljön.
Utmaningar för förstärkning smittsamma prionproteiner är långa inkubationstider och kostnader för in vivo-studier. Den PMCA tekniken är ett kostnadseffektivt sätt att förstärka smittsamma prion ämnen. Flera laboratorier har bekräftat förmågan hos PMCA att noggrant förstärka prion stammar in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Prionsjukdomar kan överföras mellan arter. Bessen och Marsh har i praktiken inokulerade hamstrar med överförbar mink encefalopat…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Vesper Fe Marie Ramos för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 och G20RR024001) och Institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (2R01 NS052609).
Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |