Summary
Protein felveckning cyklisk förstärkning (PMCA) är en in vitro-analys för att studera prioner konvertering och påfrestningar och arter hinder. Den kan också användas som en prion detektionsanalys.
Abstract
Prioner är smittämnen som orsakar oundvikligen dödlig transmissibel spongiform encefalopati (TSE) hos djur och människor 9,18. Prionproteinet har två distinkta isoformer, icke-infektiösa värd-kodade proteinet (PrP ^) och infektiöst protein (PrP ^), en onormalt vikta isoformen av PrP ^ 8.
En av utmaningarna med att arbeta med prion medel är den långa inkubationstiden före utvecklingen av kliniska tecken efter värd ympning 13. Detta uppdrag traditionellt långa och dyra djurförsök bioassay. Dessutom är de biokemiska och biofysiska egenskaper hos PrP dåligt karakteriseras på grund av deras ovanliga konformation och aggregering stater.
PrP kan utsäde omvandlingen av PrP ^ till PrP ^ in vitro 14. PMCA är en in vitro-teknik som tar Advantage av denna förmåga med hjälp sonikering och inkubering cykler för att producera stora mängder PrP ^, i en ökande takt, från ett system innehållande överskottsmängder av PrP ^ och små mängder av PrP Sc frö 19. Denna teknik har visat sig effektivt rekapitulera art och stam specificitet PrP omvandling från PrP ^, för att emulera interferens prionstam, och för att förstärka mycket låga nivåer av PrP från infekterade vävnader, vätskor, och miljöprover 6,7,16, 23.
Detta dokument specificerar PMCA protokoll, inklusive rekommendationer för att minimera kontaminering, genererar konsekventa resultat och kvantifiera dessa resultat. Vi diskuterar också flera PMCA program, inklusive produktion och karakterisering av smittsamma prion stammar, prionstam störningar samt upptäckt av prioner i miljön.
Protocol
1. Förbereda utrustning
- Använd en Misonix 3000 eller Misonix 4000 sonikator (Farmingdale, NY) kopplad till en Thermo Electron Neslab EX-7 vattenbad (Newington, NH) för att hålla en konstant temperatur på 37 ° C. Sonikera proverna i 200 ^ tunnväggiga PCR-rör band med välvda lock som erhållits från Thermo Scientific (Waltham, MA).
- En helt ny sonikator kräver en "break-in" period av kontinuerlig drift 9. En två månaders inkörningsperiod består av en 40-sek ultraljudsbehandling sprack och 10-minuters cykler inkubation med amplituden inställd på 10. Man bör observera erosion hela titanytan mikroplattan hornet (figur 1, fält B). Det cirkulerande vattnet ser vitgrumlig grund av erosion av titan mikroplattan horn. Ersätt detta vatten dagligen.
- Förstärkningen av PrP Sc varierar hela mikroplattan horn. Den bästa PrP amplifieringseffektiviteten kan erhållas inomen radie av 5 cm från centrum av mikroplattan hornet (se figur 1, panel C).
- En omgång av PMCA består 144 cykler. Varje cykel består av 5 sek sonikering och 10 min inkubation. Detta kommer ungefär medför till 24 timmar per omgång PMCA.
- Uteffekten av sonikering, visas på sonikator kontrollpanel, varierar med antalet PCR-rör som finns i sonikator rack och temperaturen hos det cirkulerande vattnet från vattenbadet. Se till att vattnet är i jämvikt vid 37 ° C och inte fylla mer än 30% av sonikator s röret rack (Figur 1, panel C). Sprid PCR-rören genom mikroplattan horn. Ha minst en rad av tomt utrymme mellan PCR-rör band och låta högst fyra tuber sammankopplade per band (figur 1, panel C).
- Styrkan av sonikering är avgörande för en framgångsrik prionstam amplifiering. Medan sonikering, justera amplituden har en uteffektvarierar mellan 155 ~ 170 watt. I vårt laboratorium effektnivån är inställd på sex och sju för Misonix 3000 och Misonix 4000, respektive.
- Använd destillerat vatten i vattenbadet för att undvika att ackumulera hårt vatten fläckar. Ersätt detta vatten varje vecka. Under inkubationen och ultraljudsbehandling cykler kommer kondens uppstå i mikroplattan horn lock. För att undvika kondens, bifoga en liten pad akvarium värme till toppen av sonikator hölje rutan som visas i figur 1, panel A.
2. Förbereda prover
- Alla som deltar i djurförsök godkändes av Creighton University Institutional Animal Care och användning kommittén och följa guide för vård och användning av försöksdjur. Innan någon vävnad samling måste djuret vara bedövas och transkardiellt perfuserades med iskall fosfatbuffrad saltlösning med 5 mM EDTA vid pH 7,4 för att avlägsna blod från hjärnan och undvika hämning avPMCA reaktion av blod 7. Samla djurvävnader snabbt med aseptisk teknik och har dedikerade dissekering verktyg för varje prionstam. Efter dissektion, placera vävnaden i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, blixt frysa den på torris och förvara den vid -80 ° C tills homogenisering.
- För att framställa PMCA substratet (PrP ^)-lösning, homogenisera en oinfekterad hamsterhjäma (FN BH) till en 10% vikt / volym (vikt / volym) lösning med iskall buffert omvandling (se del 3) med användning av en vävnad Tenbroeck kvarn. Medan homogenisering, vara noga med att inte få luft i kvarnen för att undvika överdriven skumning av lösningen. Klargöra lösningen genom centrifugering vid 500 x g under 30 sek och alikvot av supernatanten i 1,5 ml mikrorör. Lagra vid -80 ° C tills vidare användning.
- För att framställa PMCA utsäde (PrP ^)-lösning, homogenisera ett infektiöst material (hjärna, mjälte, lymfkörtlar, andra vävnader eller förorenad mark) till en 10% vikt / volym lösning med iskall water och alikvot av lösningen i 0,6 ml mikrocentrifugrör. Lagra vid -80 ° C tills vidare användning.
3. Förbereda Konvertering buffert
- Väg 0,5093 g Triton X-100 i en 50 ml mätkolv (Resultatet är en 1% slutlig koncentration av Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Tyskland).
- Lägg ett Komplett Tablet proteashämmare (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland).
- Lägg 0,0931 g EDTA (detta kommer att resultera i en 5 mM slutlig koncentration EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ).
- Justera pH till 7,4 med 1 N NaOH.
- Justera volymen till 50 ml med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA).
- Filtrera lösningen genom ett 0,45 | im nitrocellulosamembran med en vakuumfiltrering apparat. Omvandlingen bufferten kan lagras vid 4 ° C under högst en månad.
4. Förstärkning av Prioners stammar Använda PMCA
- Späd PMCA frö i PMCA substratet vid ett förhållande av 1:20 (dvs. blandning 5 ul av PMCA utsäde och 95 ul av PMCA substratet) till en PCR-rör. Avlägsna och lagra en 15 pl alikvot vid -80 ° C för unsonicated kontroll, detta unsonicated kontroll kommer att användas för att kvantifiera PrP ^ amplifiering genom proteinas K (PK) digerering följt av Western blöt (WB) analys. En ytterligare unsonicated kontroll kunde alstras genom att placera en andra 15 pl alikvot vid 37 ° C under den tid som PMCA reaktionen. Minst tre upprepningar krävs för statistiska ändamål.
- Ämne resten av provet (70 | il) till en omgång av PMCA såsom visas i figur 1, panel A Shake rör var 5 tim för att undvika vattenkondensation på den kupolformade locket på PCR-rör.
- Provets rör bör centrifugeras ned och försiktigt vortex (var försiktig så att lösningen inte gå in på kupolförsedda lock) innan du öppnar efter ett förfarande för att säkerställa homogeneity och undvika eventuella föroreningar.
- För seriell PMCA (sPMCA) korta stammar inkubationstid (dvs. HY TME, HaCWD eller 263K), späd sonikerade materialet i förhållandet 1:20 genom att överföra 5 ul av den sonikerade prov från rund en till 95 pl färsk oinfekterad hjärnhomogenat (figur 2, panel B).
- För sPMCA av långa stammar inkubationstid (dvs. DY TME, 139H, 22CH, 22AH eller ME7H), späd sonikerade materialet vid ett förhållande av 1:1 genom överföring 50 ul av den sonikerade prov från rund en i 50 pl färsk oinfekterad hjärnhomogenat (figur 2, panel B).
- Ta två 15 pl alikvoter från den tidigare utspädd sonikerade blandning (från steg 4,4 eller 4,5) och lagra en av dem vid -80 ° C och den andra vid 37 ° C (unsonicated kontroll lösningar för PMCA runda två). Utsätta resterna till en PMCA runda två.
- Denna procedur kan upprepas i det oändliga. I vårt laboratorium har viha utfört upp till femton PMCA rundor, med töjningsegenskaper oförändrade.
- PK smälta proverna. För en typisk WB, blanda 5 il PK 80 pg / ml till 5 pl prov (denna lösning kommer att ha en slutlig PK koncentration av 40 pg / ml) och inkubera vid 37 ° C under en timme. Tillsätt 10 | il av gelladdningsbuffert. Koka denna lösning under 10 min. Låt lösningen svalna och ladda 10 pl in i gelén.
- För att beräkna en framgångsrik förstärkning utföra en WB-analys på PK-spjälkade prover för att uppskatta mängden förstärkt PrP genom att jämföra dem heller, 20,21 Figur 2, panel C eller till kända mängder av unsonicated kontroller PK-osmält rekombinant PrP.
5. Undvika Korskontaminering
Kritiska steg måste tas för att minimera korskontaminering och förekomsten av falska positiva beroende på de novo bildning av produkter proteasresistenta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein felveckning cyklisk amplifiering (PMCA) används för att amplifiera PrP in vitro 7, 12, 14, 19, 24. En framgångsrik PrP amplifiering visas genom en ökning i bandintensitet på Western-blottar av PK-resistent prionprotein (migrera mellan 19 och 30 kDa för hamster-härledda prion stammar) som visas i figur 3. Efter Ökningen i bandintensitet PMCA indikerar amplifiering av PK-PrP Sc material. Framgångsrik amplifiering av hamster-härledda prionprotein, HaCWD och DY TME, visas i WB-analys i figur 3 genom att jämföra bandintensiteterna innan (spår 5 och 7) och efter (spår 4 och 6) PMCA.
PK digestion av PrP ^ °, följt av WB-analys visar en övre, mellersta och nedre band motsvarande di-, mono-och oglykosylerade prionprotein, respektive. Vissa prion stammar kan differentieras genom sin electrophoretic rörlighet. Till exempel finns det en två-kDa skillnad i migration mellan HaCWD och dy TME-stammar prion. (Figur 3, spår 1 och 2, respektive).
En hifi PrP ^ amplifiering uppnås genom PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24. Denna hifi i PMCA amplifiering observeras med en liknande elektroforetisk migration av PMCA-amplifierade prion stammar (HaCWD och DY TME) jämfört med deras motsvarande frön (Figur 3, banorna 1 och 4 och 2 och 6 för HaCWD och DY TME, respektive).
Om ingen korskontaminering eller de novo PrP bildning inträffar bör WB analys av mock kontroll PMCA prover vara klart efter PK matsmältning (Figur 3, spår 8 och 9).
Figur 1. För att undvika vattenkondensation, värme-pad en vanlig akvarium placeras ovanför locket av mikroplattan hornet (panel A). En helt ny sonikator bör få en inkörningsperiod av kontinuerlig ultraljudsbehandling i cirka två månader. Panel B visar erosionen på titan mikroplattan horn efter inkörningsperioden. Panel C visar ett möjligt arrangemang av PCR tube remsor som skulle möjliggöra en optimal sonikering av proven.
Figur 2. Flödesschema för PMCA (panel A), sPMCA (panel B), och WB-analys (panel C). PrP är PMCA frö och oinfekterade hjärnhomogenat (FN BH) är PMCA substratet. Kvantifieringen av det förstärkta PrP ^ för varje PMCA runda erhålls genom att dividera bandets intensitet efter PMCA av dess motsvarande bandintensiteten före PMCA.
Figur 3. Western blöt av PK-digererad HaCWD och DY TME hamster-härledda stammar prion. PrP detekteras med 3F4 mot prion-antikroppen. Analys av WB visar överflöd (blot intensitet) och elektroforetisk rörlighet PrP. PMCA reaktioner såddes med hjärnhomogenat från hamstrar infekterade med antingen HaCWD (banorna 4-5) eller DY TME (spår 6-7) agenter. Prover som genomgick PMCA (PMCA +) visar en ökning av PrP ^ överflöd jämfört med deras oamplifierade (PMCA -) kontroller (jämför spår 5 till 4 och 7 till 6). Det är en två-kDa-skillnad i den elektroforetiska migrationen mellan prionproteiner i HaCWD och DY TME (banorna 1-2). Denna skillnad i migrering upprätthålls i PMCA genererade prover med HaCWD och dy TME homogenat (spår 4 respektive 6). PMCA reaktioner sådda med infekterade hjärna (mock) homogenat inte förstärka PrP Sc (spår 8). Platserna för de 19 och 21 kDa molekylära markörer indikeras till vänster på panelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utmaningar för förstärkning smittsamma prionproteiner är långa inkubationstider och kostnader för in vivo-studier. Den PMCA tekniken är ett kostnadseffektivt sätt att förstärka smittsamma prion ämnen. Flera laboratorier har bekräftat förmågan hos PMCA att noggrant förstärka prion stammar in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Prionsjukdomar kan överföras mellan arter. Bessen och Marsh har i praktiken inokulerade hamstrar med överförbar mink encefalopati, som producerade två distinkta hamster-härledda prion stammarna 5. I en elegant studie Telling och medarbetare använde sPMCA att förstärka mus-härledda prionstam, RML, med transgena möss som uttrycker hjortdjur PrP C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) som PMCA substrat. En snabbt insättande av sjukdomen observerades efter ympning av Tg (CerPrP) 1536 + / - med PMCA-anpassade materialet 12. Likaså, var Kurt et al. Kunna amplifierachronic wasting disease (CWD), en prion sjukdom hos hjortdjur, användning av icke-hjortdjur arter PMCA substrat 15. Dessa data tyder på att arter barriär i prionsjukdomar kan kringgås in vitro via PMCA.
Bessen och Marsh har visat att hamstern korta inkubationstiden stam, HY TME, har en snabbare PrP ^ ackumulering jämfört med dess långa inkubationstiden motsvarighet, DY TME 3, 5. På liknande sätt är denna korrelation mellan inkubationsperioden och ackumulering som observerades efter PMCA i flera hamster-härledda prion stammarna 1, 23, 24.
Förstärkningen kurs är en egenskap inneboende i varje stam. PMCA har använts för att kvantifiera denna amplifiering takt. Ayers et al. Kunde beräkna ett enhetslös nummer, benämnt amplifiering koefficient, som representerar graden av förstärkningen för en given hamster-härledd prionstam 1.
Prionstammar kan störa varandra när de är närvarande i samma värd. Närvaron av en lång inkubationstid stam kan förlänga inkubationstiden eller blockera förmågan hos en kort inkubationstid stam för att orsaka sjukdom. Denna förlängning i inkubationstiden kallas stam störningar. Stam störningar har visats förekomma i möss 10 och hamstrar 22. Bartz och medarbetare har använt PMCA att studera störningar prionstam hos hamstrar. Deras resultat visar att PMCA experimenten korrelerar med resultaten av ett liknande experiment in vivo 22, 23.
Eftersom det finns en relativt låg nivå av PrP ^ ° utanför det centrala nervsystemet, kan prioner endast noggrant diagnostiseras post mortem genom dissekering av hjärnan följt av immunhistokemi. PMCA kan användas som diagnostiskt verktyg, eftersom det har visat en stor förmåga att amplifiera små mängder av PrP ^ ^ 7, även från hamster urin samples 11.
Det prion agenten klarar tuffa miljöer och förblir smittsam 16,17. Emellertid är mängden PrP i miljön för små för att detekteras med användning av konventionella tekniker såsom WB. PMCA har använts för att förstärka och beräkna den ungefärliga mängden PrP ^ '^ miljön, såsom jord och vatten 16, 17, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Vesper Fe Marie Ramos för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 och G20RR024001) och Institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (2R01 NS052609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
