Summary

Protein felveckning Cyklisk amplifiering av prioner

Published: November 07, 2012
doi:

Summary

Protein felveckning cyklisk förstärkning (PMCA) är en in vitro-analys för att studera prioner konvertering och påfrestningar och arter hinder. Den kan också användas som en prion detektionsanalys.

Abstract

Prioner är smittämnen som orsakar oundvikligen dödlig transmissibel spongiform encefalopati (TSE) hos djur och människor 9,18. Prionproteinet har två distinkta isoformer, icke-infektiösa värd-kodade proteinet (PrP ^) och infektiöst protein (PrP ^), en onormalt vikta isoformen av PrP ^ 8.

En av utmaningarna med att arbeta med prion medel är den långa inkubationstiden före utvecklingen av kliniska tecken efter värd ympning 13. Detta uppdrag traditionellt långa och dyra djurförsök bioassay. Dessutom är de biokemiska och biofysiska egenskaper hos PrP dåligt karakteriseras på grund av deras ovanliga konformation och aggregering stater.

PrP kan utsäde omvandlingen av PrP ^ till PrP ^ in vitro 14. PMCA är en in vitro-teknik som tar Advantage av denna förmåga med hjälp sonikering och inkubering cykler för att producera stora mängder PrP ^, i en ökande takt, från ett system innehållande överskottsmängder av PrP ^ och små mängder av PrP Sc frö 19. Denna teknik har visat sig effektivt rekapitulera art och stam specificitet PrP omvandling från PrP ^, för att emulera interferens prionstam, och för att förstärka mycket låga nivåer av PrP från infekterade vävnader, vätskor, och miljöprover 6,7,16, 23.

Detta dokument specificerar PMCA protokoll, inklusive rekommendationer för att minimera kontaminering, genererar konsekventa resultat och kvantifiera dessa resultat. Vi diskuterar också flera PMCA program, inklusive produktion och karakterisering av smittsamma prion stammar, prionstam störningar samt upptäckt av prioner i miljön.

Protocol

1. Förbereda utrustning Använd en Misonix 3000 eller Misonix 4000 sonikator (Farmingdale, NY) kopplad till en Thermo Electron Neslab EX-7 vattenbad (Newington, NH) för att hålla en konstant temperatur på 37 ° C. Sonikera proverna i 200 ^ tunnväggiga PCR-rör band med välvda lock som erhållits från Thermo Scientific (Waltham, MA). En helt ny sonikator kräver en "break-in" period av kontinuerlig drift 9. En två månaders inkörningsperiod består av en 40-sek ultraljud…

Representative Results

Protein felveckning cyklisk amplifiering (PMCA) används för att amplifiera PrP in vitro 7, 12, 14, 19, 24. En framgångsrik PrP ​​amplifiering visas genom en ökning i bandintensitet på Western-blottar av PK-resistent prionprotein (migrera mellan 19 och 30 kDa för hamster-härledda prion stammar) som visas i figur 3. Efter Ökningen i bandintensitet PMCA indikerar amplifiering av PK-PrP Sc material. Framgångsrik amplifiering av hamster-härle…

Discussion

Utmaningar för förstärkning smittsamma prionproteiner är långa inkubationstider och kostnader för in vivo-studier. Den PMCA tekniken är ett kostnadseffektivt sätt att förstärka smittsamma prion ämnen. Flera laboratorier har bekräftat förmågan hos PMCA att noggrant förstärka prion stammar in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.

Prionsjukdomar kan överföras mellan arter. Bessen och Marsh har i praktiken inokulerade hamstrar med överförbar mink encefalopat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Dr Vesper Fe Marie Ramos för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 och G20RR024001) och Institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (2R01 NS052609).

Materials

Reagent / Equipment Manufacturer Cat. Number
Misonix 3000 Misonix S-3000
Misonix 4000 Misonix S-4000
Tenbroeck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
EDTA J.T. Baker 4040-00
DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

References

  1. Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
  2. Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
  3. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
  4. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
  5. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
  6. Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
  7. Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
  8. Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
  9. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
  10. Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
  11. Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
  12. Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
  13. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
  14. Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
  15. Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
  16. Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
  17. Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
  18. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
  19. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
  20. Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
  21. Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
  22. Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
  23. Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
  24. Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
  25. Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).

Play Video

Cite This Article
Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).

View Video