En électroporations Ovo d'embryons au stade de poulet 10 HH
Summary
Poussin dans l'électroporation in ovo est une technique qui permet la manipulation génétique de l'embryon aviaire. Les applications courantes de cette technique comprennent l'analyse fonctionnelle des gènes et des éléments activateurs putatifs. Cette vidéo montre l'électroporation du tube neural chez les embryons de poussins HH 10. Technique d'injection et la manipulation correcte d'œuf sont discutées.
Abstract
Grande taille et du développement externe de l'embryon de poulet ont longtemps fait un outil précieux dans l'étude de la biologie du développement. Avec l'avènement des techniques de biologie moléculaire, le poussin est devenu un système utile pour l'étude de la régulation des gènes et leur fonction. Par électroporation constructions d'ADN ou d'ARN dans l'embryon de poulet en développement, les gènes peuvent être exprimés ou renversé afin d'analyser en fonction des gènes in vivo. De même, constructions rapporteurs peuvent être utilisées pour la cartographie de destin ou d'examiner des éléments de gènes putatifs de régulation. Par rapport à des expériences similaires chez la souris, l'électroporation chiches a l'avantage d'être rapide, facile et peu coûteux. Cette vidéo montre d'abord comment faire une fenêtre dans la coquille de manipuler l'embryon. Ensuite, l'embryon est visualisé avec une solution diluée d'encre de Chine injectée ci-dessous l'embryon. Une aiguille de verre et une pipette sont utilisés pour injecter de l'ADN et Fast colorant vert dans le tube neural de développement, puis des électrodes de platine sont placés parallèlement à l'embryon et de courtes impulsions électriques sont administrés avec un générateur d'impulsions. Enfin, l'œuf est scellé avec du ruban adhésif et replacée dans un incubateur pour le développement ultérieur. En outre, la vidéo montre stockage des œufs et à la manipulation et discute les causes possibles de l'électroporation d'embryons suivantes perte.
Protocol
Discussion
Ce protocole fournit un guide étape par étape à l'électroporation du tube neural d'embryons de poulet HH10. En plus de montrer la technique, des lignes directrices pour le stockage et la manutention des oeufs est également fourni. Cette technique présente un large éventail d'applications pour l'analyse génétique et le coût aise et peu d'expériences qui les rend possible pour de nombreux laboratoires.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | |||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable | |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | |||
| Connecter cables | ||||
| Micromanipulator | ||||
| Dissecting scope | with large working distance | |||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | |||
| Leibovitz’s L-15 media | ||||
| chicken eggs | fertilized | |||
| Curved scissors | ||||
| 10 ml syringe | ||||
| Large bore needle | 16-18G | |||
| Mouth pipette | ||||
| India ink | ||||
| Insulin syringe/syringe | ||||
| Plasmid DNA | ≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
