Pulcino in ovo elettroporazione è una tecnica che permette di manipolazione genetica dell'embrione aviaria. Comuni applicazioni di questa tecnica includono l'analisi funzionale dei geni e dei putativi elementi enhancer. Questo video dimostra l'elettroporazione del tubo neurale in HH 10 embrioni di pollo. Tecnica di iniezione e la gestione corretta di uova sono discussi.
Abstract
Grandi dimensioni e sviluppo esterno dell'embrione di pollo hanno da tempo reso un prezioso strumento nello studio della biologia dello sviluppo. Con l'avvento di tecniche biologiche molecolari, il pulcino è diventato un sistema utile per studiare regolazione genica e la funzione. Da electroporating costruisce DNA o RNA in un embrione di pollo di sviluppo, i geni possono essere espressi o abbattuto al fine di analizzare in funzione del gene in vivo. Allo stesso modo, costruisce giornalista può essere utilizzato per mappare il destino o per esaminare gli elementi gene putativo regolamentazione. Rispetto a esperimenti simili nel topo, elettroporazione pulcino ha il vantaggio di essere rapida, semplice e poco costoso. Questo video dimostra come prima di fare una finestra nel guscio d'uovo di manipolare l'embrione. Quindi, l'embrione viene visualizzato con una soluzione diluita di inchiostro di china iniettato sotto l'embrione. Un ago pipetta di vetro e sono usati per iniettare il DNA e Fast colorante verde nel tubo di sviluppo neurale, poi elettrodi di platino sono posti in parallelo per l'embrione e brevi impulsi elettrici vengono somministrati con un generatore di impulsi. Infine, l'uovo è sigillato con nastro adesivo e rimesso in un incubatore per un ulteriore sviluppo. Inoltre, il video mostra la corretta conservazione delle uova e la manipolazione e discute le possibili cause di elettroporazione in seguito alla perdita degli embrioni.
Protocol
Uovo di movimentazione Le uova possono essere conservati a 13 ° C fino a una settimana prima di incubazione senza significativa perdita di vitalità (un dispositivo di raffreddamento piccolo vino è l'ideale per questo scopo). Prima di incubazione, permettono uova a temperatura ambiente, quindi posto in un incubatore umidificato pollo impostato a 37,8 ° C (100 ° F). Noi di solito electroporate embrioni circa 48 ore dall'inizio di incubazione, quando l'embrione ha raggiunto Ha…
Discussion
Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per elettroporazione del tubo neurale HH10 di embrioni di pollo. Oltre a mostrare la tecnica, le linee guida per lo stoccaggio e il trattamento delle uova è prevista anche. Questa tecnica ha una vasta gamma di applicazioni per l'analisi genetica e la facilità ea basso costo di esperimenti li rende fattibile per molti laboratori.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Chicken egg incubator
humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator
Genetronics
BTX T820
Square wave generator or comparable
Electrodes
our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope
with large working distance
Glass capillaries
and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs
fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle
16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA
≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye