Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.
Abstract
Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.
Protocol
Manipulação de ovos Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade). Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F). Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingi…
Discussion
Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Chicken egg incubator
humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator
Genetronics
BTX T820
Square wave generator or comparable
Electrodes
our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope
with large working distance
Glass capillaries
and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs
fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle
16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA
≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye