I Ovo Electroporations av HH Stage 10 kycklingembryon

Summary

Chick i ovo elektroporering är en teknik som möjliggör genetisk manipulation av aviär embryot. Vanliga tillämpningar av denna teknik med funktionell analys av gener och förmodade förstärkare element. Denna video visar neuralrörsdefekter elektroporation i HH 10 kycklingembryon. Injektionsteknik och korrekt ägg hantering diskuteras.

Abstract

Stor storlek och extern utveckling av kyckling embryot har länge gjort det ett värdefullt verktyg för att studera utvecklingsbiologi. Med tillkomsten av molekylärbiologiska tekniker, har ungen blivit ett användbart system där för att studera genreglering och funktion. Genom electroporating DNA eller RNA konstruktioner i utvecklingsländerna kyckling embryot kan gener uttryckas eller slås ned för att analysera in vivo geners funktion. Likaså kan reporter konstruktioner användas för ödet kartläggning eller för att undersöka förmodade gen reglerande element. Jämfört med liknande experiment i mus, har chick elektroporation fördelarna med att vara snabbt, enkelt och billigt. Denna video visar först hur att göra ett fönster i äggskalet att manipulera embryot. Därefter är embryot visualiseras med en utspädd lösning av tusch injiceras under embryot. Ett glas nål och pipett används för att injicera DNA och Fast grönt färgämne i utvecklingsländerna neuralrörsdefekter, då platina elektroder placeras parallellt med embryot och korta elektriska pulser ges tillsammans med en pulsgenerator. Slutligen är ägget förseglade med tejp och läggs tillbaka i en inkubator för vidare utveckling. Dessutom visar videon korrekt ägget lagring och hantering och diskuterar möjliga orsaker till embryoförlust efter elektroporation.

Protocol

Egg hantering

1. Ägg kan förvaras vid 13 ° C i upp till en vecka före inkubation utan betydande förlust av livskraft (en liten vinkyl är perfekt för detta ändamål).
2. Innan inkubation, låt ägg till rumstemperatur och placeras sedan i en fuktig kyckling inkubator inställd på 37,8 ° C (100 ° F).
3. Vi electroporate brukar embryon ungefär 48 timmar från starten av inkubationstiden, när embryot har nått Hamburger och Hamilton steg 10.
4. Tid för inkubationstiden kan variera beroende på önskad Hamburger och Hamilton skede. Temperaturen är kritisk och avvikelse från optimal inkuberingstemperatur kommer att förändra inkubationstid och minska embryo livskraft.
5. Under inkubation, skall äggen förvaras på sidorna så att embryot blir ordentligt positionerat för elektroporation. Embryot flyter ovanpå äggulan och det är bra att märka upp ägget med en penna innan fönstersystem så att du vet var du ska skära.

Förberedelser

1. Varm Leibovitz L-15 media till 37 ° C. Dra glas kapillärer in nålar. Placera elektroderna och mikromanipulator och anslut elektroderna till pulsgeneratorn.

Fönstring

1. Med hjälp av en spruta med stor nål, hål i skalet på den smala änden av ägget.
2. Pekar nålen försiktigt nedåt för att förhindra störningar av äggulan, ta bort ca 5 ml albumin.
3. Täta hålet med en liten bit tejp.
4. Täck toppen av ägget med en annan bit tejp (ca 4x4 cm).
5. Använda böjd sax, och noga med att inte störa embryo, skär ett hål precis stort nog för att ge ett fönster för att arbeta.

Tillval: För att visualisera neuralrörsdefekter, injicera bläck lösning med 26 gauge nål under embryot (in nålen under ett embryo utanför blodet ringen). Tusch bör spädas 1:05 med Hanks eller liknande buffrad steril lösning.

Injektion och elektroporation

1. Bryt kapillär tips till önskad diameter med pincett
2. Med hjälp av munnen pipett ladda kapillär med plasmiden / Fast grönt färgämne.
3. Placera embryo med huvudet mot dig och för in nålen i neuralröret i en flack vinkel.
4. Injicera plasmiden lösning i lumen i neuralröret tills färgen fyller hela rummet.

Obs: Var noga med att inte ha spets större då neuralrörsdefekter diameter. I allmänhet kommer du att kunna berätta om den optimala spets storlek har uppnåtts genom hur lätt eller svårt det är att dra vätska i kapillär. Om det finns extremt motstånd, är öppna nog för liten och spetsen ska brytas igen högre upp. Om det finns lite eller inget motstånd, är öppningen för stor och en ny nål ska användas.

1. Placera 1-2 droppar steril L-15 media på embryot.
2. Placera omedelbart elektroder på vardera sidan av embryot, parallellt med neuralrörsdefekter, och pulsen 5 gånger på 10-24 volt 50 mseconds med 1 sekunds intervall. Du kommer att se bubblor i närheten av elektroderna om det fungerade ordentligt.
3. Ta försiktigt bort elektroderna, lägga 5 droppar L-15 på toppen av embryon och försegla ägget med tejp. Se till att ägget är väl förseglade, som torkning är en viktig bidragsgivare till embryo förlust efter elektroporation.
4. Placera ägg tillbaka in i inkubatorn, fönster uppåt och inkubera tills de når önskad H & H skede.

Discussion

Detta protokoll ger en steg för steg guide till neuralrörsdefekter elektroporering av HH10 kycklingembryon. Förutom att visa tekniken, är riktlinjer för lagring och hantering av äggen också. Denna teknik har ett brett spektrum av tillämpningar för genetisk analys och den lätthet och låg kostnad av experiment gör dem möjliga för många laboratorier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye