Topologi af celleadhæsion på et substrat måles med nanometer præcision ved variabel vinkel total intern refleksion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM).
Overflade topologi, fx af celler, der vokser på et substrat, bestemmes med nanometer præcision ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). Cellerne dyrkes på gennemsigtige objektglas og inkuberet med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembran. Belysning sker ved en parallel laserstråle under variable vinkler af total indre refleksion (TIR) med forskellige indtrængningsdybder af det rumligt dæmpede elektromagnetiske felt. Optagelse af fluorescensbilleder ved bestråling ved omkring 10 forskellige vinkler tillader at beregne celle-substrat-afstande med en præcision på nogle få nanometer. Forskelle i adhæsion mellem forskellige cellelinier, fx cancerceller og mindre maligne celler, bestemmes således. Endvidere kan eventuelle ændringer i celleadhæsion ved kemisk eller fotodynamisk behandling undersøges. I sammenligning med andre metoder til super-opløsning mikroskopi lys eksponering holdesmeget lille, og ingen beskadigelse af levende celler forventes at forekomme.
Når en lysstråle udbreder sig gennem et medium med brydningsindex n 1 møder en grænseflade til et andet medium af brydningsindeks n2 <n1, total intern refleksion forekommer i alle indfaldsvinkler Θ, som er større end den kritiske vinkel Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Trods bliver totalt reflekteret den indfaldende lysstråle fremkalder en rumligt dæmpede elektromagnetiske felt, der trænger ind i det andet medium og henfalder eksponentielt med vinkelrette afstand z fra grænsefladen ifølge I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) svarer til intensiteten af det elektromagnetiske felt og d (Θ) til indtrængningsdybden ved bølgelængden λ, som givet ved
d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ – n 2 2) -1 / 2
Som rapporteret i litteraturen 1,2, I 0 </sub> svarer til intensiteten af indfaldende lys I e ganget med transmissionen faktor T (Θ) og forholdet n 2 / n 1. Hvis det elektriske felt vektor af denne lysstråle er polariseret vinkelret på planet af forekomsten (dvs. planet udspændt af den indfaldende og den reflekterede stråle), er denne transmissionsfaktor givet ved
T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 – (N 2 / nL 1) 2]
For den detekterede fluorescens-intensitet i TIRFM målinger, har lysabsorption, der skal integreres over alle lag i prøven og multipliceret med fluorescens kvantumudbytte η af den pågældende farvestof og med topvinklen i detektion Ω. Som rapporteret tidligere 3, kan denne intensitet blive beskrevet ved
I F (Θ) = AT (Θ) nOC (Z) e-z / d (Θ) dz
hvis alle de faktorer, der er uafhængige f rom indfaldsvinklen Θ og koordinat z er indbefattet inden for eksperimentel konstant A. Ligning 3 kan løses analytisk, hvis koncentrationen c (z) af fluoroforer anses for at være næsten konstant
– Enten overhovedet koordinaterne z ≥ Δ, fx i cytoplasmaet af celler med en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde har integralet skal beregnes ud fra z = Δ til z = ∞ resulterer i
Jeg F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ)
– Eller mellem z = Δ – t / 2 og z = Δ + t / 2, dvs i et tyndt lag af tykkelsen t, fx en cellemembran beliggende i en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde kan fluorescensintensiteten beregnes som
Jeg F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ),
hvis t er lille i sammenligning med Δ.
Som rapporteret tidligere 3, image erhvervelse og evaluering kræver
– Homogen fordeling af excitationslyset over prøven,
– Gyldigheden af en 2-lags model (med brydningsindekserne n 1 og N2 i substratet og cytoplasmaet, henholdsvis). Dette gælder, når plasmamembranen er meget tynd, og hvis laget af det ekstracellulære medium (mellem cellen og substratet) er lille i forhold til bølgelængden for det indfaldende lys.
Endvidere kan en moderat numerisk apertur(Typisk A ≤ 0,90) af mikroskopet objektivlinsen er fordelagtigt at undgå afvigelser i lysstyrken på grund af anisotropi af stråling i den nærmeste område af det dielektriske grænseflade.
Der beskrives en fremgangsmåde til måling af celle-substrat-afstande med nanometer præcision. I øjeblikket metoder til super-opløsning mikroskopi, fx baseret på struktureret belysning 7 eller på enkelt molekyle detektion 8-10 samt stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi 11 er af betydelig interesse. Ingen af disse teknikker er imidlertid, tillader en aksial opløsning under 50 nm. Desuden W / cm 2 ret høj bestråling på 50.100 er nødvendig for …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker delstaten Baden-Württemberg og Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung – til finansiering ZAFH-PHOTON n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) for finansiering af forskning tilskud no. 1792C08 samt Baden-Württemberg-Stiftung GmbH til finansiering af projektet "Aurami".
Name | Company | Type | Comments |
Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |