Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Summary

Topología de la adhesión celular sobre un sustrato se mide con una precisión nanométrica de ángulo variable total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM).

Abstract

Topología de la superficie, por ejemplo de células que crecen sobre un sustrato, se determina con una precisión nanométrica de ángulo variable total Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna (VA-TIRFM). Las células se cultivan en portaobjetos transparentes y se incubaron con un marcador fluorescente distribuido homogéneamente en su membrana plasmática. Iluminación se produce mediante un rayo láser paralelo bajo ángulos variables de reflexión interna total (TIR) ​​con diferentes profundidades de penetración del campo electromagnético evanescente. Grabación de imágenes de fluorescencia tras la irradiación en alrededor de 10 diferentes ángulos permite calcular distancias sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. Las diferencias de adhesión entre las distintas líneas celulares, por ejemplo células cancerosas y las células malignas, son menos así determinada. Además, los posibles cambios de la adhesión celular a un tratamiento químico o fotodinámica puede ser examinado. En comparación con otros métodos de super-resolución exposición microscopía de luz se mantienedaño muy pequeño, y no de las células vivas se espera que ocurra.

Introduction

Cuando un haz de luz que se propaga a través de un medio de índice de refracción n ₁ cumple una interfaz a un segundo medio de índice de refracción n ₂ <n _1, la reflexión interna total se produce en todos los ángulos de incidencia Θ, que son mayores que el ángulo crítico _c = Θ arcsen (n ₂ / n _1). A pesar de estar totalmente reflejada del haz de luz incidente evoca un campo electromagnético evanescente que penetra en el segundo medio y decae exponencialmente con la distancia perpendicular z desde la interfaz de acuerdo a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde a la intensidad del campo electromagnético y d (Θ) a la profundidad de penetración en la longitud de onda λ, como se da

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sen ² Θ – n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Como se informó en la literatura ^1,2, I ₀ </sub> corresponde a la intensidad de luz incidente I _e multiplica por el factor de transmisión T (Θ) y la relación n ₂ / n _1. Si el vector de campo eléctrico de este haz de luz es polarizada perpendicular al plano de incidencia (es decir, el plano generado por el incidente y el rayo reflejado), este factor de transmisión está dada por

T (Θ) = 4 cos Θ ² / [1 – ₍₂ n / nL ₁₎ ^2]

Por la intensidad de fluorescencia detectada en mediciones TIRFM, absorción de la luz tiene que ser integrado en todas las capas de la muestra y multiplicado con el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante η pertinente, así como con el ángulo sólido de detección Ω. Como se informó previamente ^3, esta intensidad puede ser descrito por

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

si todos los factores que son independientes f rom el ángulo de incidencia Θ y la coordenada z se incluyen dentro de la ecuación experimental A. constante 3 se pueden resolver analíticamente, si la concentración de c (z) de los fluoróforos se considera que es casi constante

– Bien en todas las coordenadas z ≥ Δ, por ejemplo, en el citoplasma de las células que tienen una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la integral tiene que ser calculado de z = Δ para z = ∞ resulta en

I _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– O entre z = Δ – t / 2 y z = Δ + t / 2, es decir, dentro de una capa fina de espesor t, por ejemplo, una membrana de célula que se encuentran a una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la intensidad de fluorescencia puede ser calculada como

I _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

si t es pequeño en comparación con Δ.

ent "> De las ecuaciones (4) y (5) las distancias sustrato de células-Δ se puede calcular, si las imágenes de la intensidad de fluorescencia I _F se registran para ángulos variables Θ, y si ln (I _F / T d) (Ec. 4) o ln (I _F / T) (Ec. 5) se evalúa como una función de 1 / d para estos ángulos. Para la membrana marcador laurdan utiliza en este documento (s. a continuación) la evaluación se realizó de acuerdo a la ecuación. 5.

Como se informó anteriormente ^3, adquisición de imágenes y requiere una evaluación
– Distribución homogénea de la luz de excitación sobre la muestra,
– Validez de un modelo 2-capa (con los índices de refracción N ₁ y N ₂ para el sustrato y el citoplasma, respectivamente). Esto es, si la membrana plasmática es muy delgada, y si la capa del medio extracelular (entre la célula y el sustrato) es pequeño comparado con la longitud de onda de la luz incidente.

Además, una apertura numérica moderada(Típicamente un 0,90 ≤) de la lente objetivo del microscopio es ventajoso para evitar desviaciones de brillo debido a la anisotropía de la radiación en el campo cerca de la interfaz dieléctrico.

Protocol

1. Siembra y la incubación de células Se siembran las células individuales, por ejemplo U373-MG o U-251-MG células de glioblastoma a una densidad típica de 100 células / mm 2 sobre un portaobjetos de vidrio y crecer para 4872 hr en medio de cultivo (por ejemplo, RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y antibióticos), utilizando una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. Se incuban las células con un marcador de membrana, por ejemplo, 6…

Discussion

Se describe un método para la medición de distancias en el sustrato de células con una precisión nanométrica. En la actualidad, los métodos de microscopia de super-resolución, por ejemplo, sobre la base de iluminación estructurada ⁷ o en un solo ^8-10 moléculas de detección, así como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía ¹¹ son de considerable interés. Ninguna de estas técnicas, sin embargo, permite una resolución axial por debajo de 50 nm. Ad…

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera