Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

Published: October 2, 2012 doi: 10.3791/4133
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Hochschule Aalen, Institut für Angewandte Forschung

Summary

يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).

Abstract

يتم تحديد سطح طوبولوجيا، على سبيل المثال من الخلايا المتزايد على ركيزة، بدقة نانومتر بواسطة متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM). تزرع الخلايا على شرائح شفافة وحضنت مع علامة نيون متجانس في توزيع غشاء البلازما الخاصة بهم. الإضاءة يحدث من قبل شعاع الليزر موازية تحت زوايا متغير من التأمل الداخلي الإجمالي (TIR) ​​مع اختراق أعماق مختلفة من المجال الكهرومغناطيسي زائل. تسجيل الصور مضان على التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة يسمح لحساب الخلية الركيزة المسافات مع دقة بضعة نانوميتر. وبالتالي يتم تحديد الاختلافات في الالتصاق بين مختلف خطوط الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الخبيثة أقل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فحص التغييرات المحتملة من التصاق الخلية عند الكيميائية أو العلاج الضوئي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب فائقة القرار يتم الاحتفاظ المجهر التعرض للضوءومن المتوقع الضرر صغيرة جدا، وليس من الخلايا الحية أن تحدث.

Introduction

عندما شعاع ضوء نشر من خلال وسيط من ن معامل الانكسار 1 يلتقي واجهة لوسيلة الثاني من معامل الانكسار ن 2 <ن 1، الانعكاس الداخلي الكامل يحدث في جميع زوايا Θ الإصابة، والتي هي أكبر من الزاوية الحرجة = Θ ج جيب الزاوية القوسي (ن 2 / ن 1). على الرغم من أن تنعكس تماما شعاع ضوء الحادث يثير حقل الكهرومغناطيسي التي تخترق زائل في المتوسطة الثانية ويضمحل بشكل كبير، مع عمودي المسافة Z من واجهة وفقا لI (ض) = I 0 EZ / د (Θ). I (ض) يتوافق مع شدة المجال الكهرومغناطيسي ود (Θ) إلى عمق الاختراق في الطول الموجي λ، كما تم تقديمها من قبل

د (Θ) = (λ/4π) (ن 1 2 2 الخطيئة Θ - ن 2 2) -1 / 2

كما ورد في الأدب 1،2، I 0 ه مع ناقل حركة T عامل (Θ) ونسبة ن 2 / ن 1. إذا كان الحقل الكهربائي المتجه من هذا شعاع ضوء عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة (أي طائرة امتدت من جراء الحادث وينعكس شعاع)، ويرد هذا العامل انتقال المرض من خلال

T (Θ) = 4 جتا 2 Θ / [1 - (ن 2 / NL 1) 2]

لكثافة مضان الكشف في القياسات TIRFM، امتصاص الضوء يجب أن تكون متكاملة على جميع طبقات من العينة وتضاعفت مع العائد مضان η الكم من الصبغة ذات الصلة وكذلك مع زاوية صلبة من Ω الكشف. وكما ذكر سابقا 3 يمكن أن توصف هذه الكثافة من قبل

I F (Θ) = AT (Θ) شو (ض) E-Z / د (Θ) DZ

إذا جميع العوامل التي هي مستقلة و يمكن حلها المضغوط يتم تضمين زاوية السقوط Θ وZ تنسيق داخل المعادلة A. ثابت التجريبية 3 التحليلية، إذا تم اعتبار تركيز ج (ض) من fluorophores أن تكون ثابتة تقريبا

- إما في جميع Δ ≥ Z إحداثيات، على سبيل المثال داخل السيتوبلازم من الخلايا وجود Δ المسافة من واجهة. في هذه الحالة، لابد من لا يتجزأ من حساب Δ = Z = ∞ إلى الياء مما أدى إلى

I F = A ج T (Θ) د (Θ) E-Δ / د (Θ)

- أو بين Z = Δ - T / 2 و z = Δ + T / 2، أي في غضون طبقة رقيقة من سمك ر، على سبيل المثال غشاء الخلية تقع على مسافة Δ من واجهة. في هذه الحالة، يمكن حساب كثافة مضان كما

I F = A ج T (Θ) TE-Δ / د (Θ)،

إذا ر صغير بالمقارنة مع Δ.

يمكن الأنف والحنجرة "> من المعادلات (4) و (5) مسافات الخلايا الركيزة تحسب Δ، إذا سجلت صور كثافة مضان I F لمتغير الزوايا Θ، وإذا LN (I F / T د) (مكافئ 4) أو يتم تقييم LN (I F / T) (مكافئ 5) بوصفها وظيفة من 1 / د لهذه الزوايا. للغشاء laurdan علامة المستخدمة في هذه الورقة (س. أدناه) تم إجراء تقييم وفقا للمعادلة 5.

وكما ذكر سابقا 3 الحصول على الصور، ويتطلب التقييم
- توزيع متجانس للضوء أكثر إثارة العينة،
- صلاحية نموذج 2-طبقة (مع مؤشرات الانكسار ن 1 ن 2 لوالركيزة والسيتوبلازم، على التوالي). هذا يحمل، إذا كان غشاء البلازما هي رقيقة جدا، وإذا كانت الطبقة المتوسطة من خارج الخلية (بين الخلية والركيزة) صغير مقارنة مع الطول الموجي للضوء الحادث.

وبالإضافة إلى ذلك، فتحة معتدلة العددية(عادة A ≤ 0.90) من عدسة المجهر الهدف هو مفيد لتجنب الانحرافات من السطوع بسبب تباين الإشعاع في حقل بالقرب من واجهة عازلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. البذر والحضانة من الخلايا

  1. الخلايا الفردية البذور، مثل U373-MG أو خلايا ورم أرومي دبقي U-251-MG في مناطق ذات كثافة نموذجية من 100 خلية / مم 2 على شريحة زجاجية وزراعتها ل4872 ساعة في ثقافة المتوسط ​​(على سبيل المثال RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل 10٪ الجنين والمضادات الحيوية) باستخدام حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. احتضان خلايا الغشاء مع علامة، على سبيل المثال 6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) تطبق لمدة 60 دقيقة عند تركيز من 8 ميكرومتر (في ثقافة المتوسط) 4، أو علامة السيتوبلازم، على سبيل المثال calcein acetomethlyester بطلب للحصول على 40 دقيقة في تركيز من 5 ميكرومتر 3، أو غشاء المرتبطة الضيائي، على سبيل المثال بروتوبرفيرين التاسع الناجمة على حضانة ساعة 4 مع السلائف 5-أمينوليفولنيك حمض (5-ALA؛ 1 ملم) 4،5.
  3. غسل الخلايا مع مستنبت أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل المجهري مضان. </ لى>

2. VA-TIRFM

  1. استخدام المجهر تستقيم، على سبيل المثال زايس Axioplan، واستبدال مكثف من قبل جهاز الإضاءة، كما هو موضح في المرجع. 3 مع نصفي كروية أو منشور زجاجي أسطواني نصفي بالإضافة إلى الشريحة بصريا كائن (انظر الشكل 1).
  2. استخدام شعاع الليزر موازية موازى التي كتبها بعد التصوير منظور الزجاج والمكونات البصرية أخرى (مثل مرآة مقعرة) مرة أخرى في شعاع نتائج موازية على سطح العينة (telecentric راي التلميذ). الحرص على أن الناقل هو مجال كهربائي عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة.
  3. استخدام مرآة للتعديل الموجود داخل المكثف الذي التقط في الطائرة العينة وينير العينة تحت زاوية متغير من الإصابة (راي كائن). قد يكون الدافع وراء المرآة قابل للتعديل بواسطة محرك الخطوة، حيث كل موقف يتوافق مع زاوية محددة جيدا من الإصابة، على النحو الذي يحدده القياسات goniometric 3
  4. معايرة موقف الزاوي من المرآة للتعديل باستخدام الزاوية الحرجة = Θ ج 61،3 ° للانتقال الزجاج المياه كقيمة ثابتة. Θ يمكن ج يمكن تصور بناء على الاختلاف من Θ عندما يذوب صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال 1 ملي النوكليوتيد فلافين، أحادي نوويد الفلافين) في الماء. موقف المرآة في Θ Θ = ج يتم تخزينها في المرآة برنامج تحديد المواقع.
  5. تعيين المعلمات من الكاميرا (عودة مضيئة أندور Ixon EMCCD، DV887DC، ANDOR التكنولوجيا، بلفاست، المملكة المتحدة 6)، بما في ذلك درجة الحرارة زيادة وقت التسجيل، وسرعة التحول.
  6. استخدام عدسة التكبير الهدف من الفتحة المناسبة والمعتدلة تفضيلي الرقمية (على سبيل المثال 40 × / 63 × 0،75 أو / 0،90 الغمر بالماء) وتوطين الشريحة الكائن في المجهر. استخدام زيت الغمر لضمان الاتصال البصري للعينة مع المنشور الزجاجي. تسجيل صور مضان من عينات متطابقة على الاختلاف منزاوية الإضاءة (Θ ≥ Θ Θ ج ج مع المقابلة إلى 64.5 ° للخلية واجهة من الزجاج). ويوصى مجموعة الزاوي من 66 ° -74 ° بخطوات من 0.5 ° ° 1 أو. استخدام تمريرة طويلة أو مناسبة الفرقة تمرير مرشح للكشف مضان.

3. تحليل البيانات

  1. قراءة الصور (على سبيل المثال في شكل ASCII) سجلت في زوايا مختلفة Θ، فضلا عن إعدادات الكاميرا (على خلفية التمييز)، والطول الموجي الإثارة ومعاملات الانكسار للزجاج (ن 1 = 1.52) وخلايا (ن 2 = 1.37) في برنامج التقييم (ابفيف؛ NanoCell). لتحسب كل مجموعة من المعلمات اختراق عمق د (Θ) ونقل عامل T (Θ) تلقائيا.
  2. حدد الصور المستخدمة لتقييم الخلايا الركيزة المسافات وفقا لمعادلة Δ 5 (علامة الغشاء) أو المعادلة 4 (السيتوبلازم علامة) والصور فردية مع غير متجانسةويجوز منع الإضاءة (ه كاشفة، ز. المشارب).
  3. صور حساب الخلايا الركيزة طوبولوجيا وحدد رمز اللون المناسب للعرض. يمكن عرض ملامح خلال تقييم بكسل الفردية، كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن استخدام هذه التشكيلات كمؤشر لجودة مناسبة.
  4. تخزين بروتوكول التقييم.

4. ممثل النتائج

وتجرى التجارب مع الممثلين إلى الخلايا المهندسة وراثيا ورم أرومي دبقي U251-MG المقدمة من السادة الأستاذ يناير Mollenhauer، قسم علم الأورام الجزيئي، جامعة جنوب الدنمارك، أودنسي. في اثنين من تلك الخلايا subclones U251 هي الجينات الكابتة للورم أو TP53 PTEN الإفراط في استخدام أعرب تيت على اساس نظام محرض التعبير، بحيث تظهر هذه الخلايا إلى احتمال انخفاض مكون للأورام ويمكن ان تعتبر أقل الخبيثة. وتستخدم الخبيثة للغاية U251-MG خلايا الجينات القامع ودون ضوابط، و-U251MG نوع الخلايا البرية عمل لمزيد من المقارنة. ويستخدم كمصدر للإثارة ليزر ديود التي ينبعث منها A سلسلة شبه مستمرة من البقول بيكو ثانية (40 ميغاهيرتز LDH400 مع سائق PDL 800-B، Picoquant، برلين، ألمانيا؛ الطول الموجي: 391 نانومتر؛:؛ نبض الطاقة معدل الرسوب 12 PJ).

في الشكل 3 صور TIRFM من U251-MG الخلايا ورم أرومي دبقي مع الجين المنشط ورم القامع TP53 وحضنت مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة) وصفت للزوايا الإصابة 66،0 °، 69.0 ° و 73.0 ° الموافق أعماق تغلغل زائل المجال الكهرومغناطيسي من حوالي 140 نانومتر و 75 نانومتر نانومتر و60، على التوالي. مع تناقص عمق الاختراق مضان يقلل كثافة في (انظر جداول)، وتنبع من مواقع أكثر سطحية من الخلايا (على سبيل المثال تنسيق الاتصالات على حوافها). خلية الركيزة مسافات (تصور في 3D الشكل من قبل رمز اللون تتراوح 0-600 نانومتر) تختلف بشدة على الخلايا بين علىلي بضعة نانوميتر (أبيض والأصفر) و250-300 نانومتر (الأحمر الداكن)، مثل الأسماء والتنسيق مسافات أكبر خلية الركيزة في منطقة قريبة. وينطبق ذلك على U251-MG ورم أرومي دبقي الخلايا مع الجينات القامع PTEN تنشيط (الشكل 4D)، في حين الخلايا الركيزة مسافات ثابتة بدلا عن U251-MG التحكم والخلايا النوع البري مع القيم النموذجية 80-100 نانومتر (أصفر؛ الشكل 4B ) و150-200 نانومتر (البرتقالي والاحمر، الشكل 4A).

الشكل 1
الشكل 1. جهاز الإضاءة لVA-TIRFM في المجهر تستقيم. مرآة للتعديل يقودها محرك الخطوة يسمح قرار الزاوي ° ± 0.25.

الشكل 2
الملف الشخصي التقييم الرقم 2. لمدة PIX ش (التخطيطي). عندما LN [I F / T (Θ)] يتم رسم بوصفها وظيفة من د / 1 (Θ)، المنحدر يمثل الركيزة الخلية Δ المسافة. عادة يتم تحديد هذا المنحدر مع دقة نحو ± 10٪. تم وضع علامة وتستبعد من التقييم - قيمة واحدة - الناتجة عن الإضاءة غير متجانسة.

الشكل 3
الرقم 3 صور TIRFM من U251-MG ورم أرومي دبقي مع الخلايا الجينات TP53 تنشيط القامع على الحضانة مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة). سجلت في زوايا مختلفة من الإضاءة (AC)؛ الخلية الركيزة مسافات تتراوح بين 0-600 نانومتر أظهرت من قبل رمز اللون (د)؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

ogether.within صفحة = "دائما"> الشكل 4
الشكل 4 الخلوي الركيزة مسافات U251-MG الخلايا glioblatoma في مجموعة من 0-600 نانومتر يتضح من رمز اللون؛ (أ) نوع البرية (ب) الضوابط، (ج) خلايا الجينات القامع مع المنشط TP53، (د) الخلايا مع المنشط PTEN الجينات القامع؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ووصف طريقة لقياس الخلايا بدقة الركيزة مسافات نانومتر. في الوقت الحاضر، وطرق فائقة القرار المجهر، مثلا على أساس منظم الإضاءة 7 أو على واحد 8-10 كشف جزيء وكذلك حفز استنفاد الانبعاثات (STED) المجهري 11 هي ذات أهمية كبيرة. أي من هذه التقنيات، ومع ذلك، يسمح قرار المحوري أقل من 50 نانومتر. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من الإشعاع عالية 50100 وهناك حاجة W / سم 2 للطرق وجزيء واحد أكثر من 3،000 2 W / سم للفحص المجهري STED. هذا يتجاوز الإشعاع الشمسي (حوالي 100 ميغاواط / سم 2) من عدة أوامر من حجمها، حتى أن الضرر السريع للخلايا الحية من المرجح أن يحدث. في VA-TIRFM التجارب، ومع ذلك، يمكن أن يقتصر الإشعاع إلى أقل من 20 ميغاواط / سم 2، والسماح مرة تعرض عدة دقائق أو ساعات حتى من دون أي ضرر على الخلايا الحية 12، بحيث طويلة الأمد مع التجارب مولالتعرض tiple يبدو ممكنا أيضا. الشروط الأساسية لكل تجربة المعايرة هي الزاوي جيدة والإضاءة متجانسة من الشرائح كائن نظيفة.

ويمكن تطبيق VA-TIRFM إلى العديد من المواضيع المتعلقة السطوح التقنية والبيولوجية، مثل القياسات من التصاق الخلية إلى ركيزة شفافة. نمو الخلايا، والهجرة الخلية أو موت الخلية يمكن (مثل موت الخلايا المبرمج)، لذلك، أن تدرس بمزيد من التفصيل. مؤخرا، تم فحص دور الكولسترول بين الخلايا على التصاق الخلايا 4. على وجه الخصوص، تبين أن تم تخفيض عدد الخلايا الركيزة اتصالات على نضوب الكولسترول 3050٪، مما يؤدي في النهاية إلى مفرزة من عدد أكبر من الخلايا من الركيزة الخاصة بهم. ودرس أيضا التصاق الخلية بناء على طلب من الضيائية التي يشيع استخدامها في العلاج الضوئي (PDT) من السرطان وأمراض أخرى 13. تبين أنه عند التعرض للضوء مسافات غير سمي ضيائي الخلية جرعات الركيزةخفضت قليلا (ربما بسبب بعض تورم في الخلية)، في حين تم الحفاظ على التنسيق 4،5 التصاقات. ولذلك، كان تشكيل الانبثاث بسبب PDT ليس من المرجح أن يحدث. التجارب الحالية تظهر الاختلافات في التصاق الخلايا السرطانية بين (ورم أرومي دبقي) والخلايا الخبيثة أقل. والتجارب تثبت فقط في المستقبل ما إذا كان يمكن استخدام هذا السلوك لتطبيقات مختلفة للتشخيص أو العلاج الدوائي.

وينبغي التأكيد على أن قياسات الخلايا الركيزة اتصالات تعود إلى بداية المجهر TIRF 14. قرار الزاوي، ومع ذلك، هناك حاجة إلى معدات معقدة نوعا ما 15، حتى الآن، وفقط في تطوير جهاز الإضاءة المدمجة لمتغير الزاوية TIRFM 3 قياسات روتينية المسموح بها الخلايا الركيزة طوبولوجيا. وبالإضافة إلى هذا المنشور TIRFM من نوع، وقدم التصغير حسب الغرض من نوع TIRFM 16،17، حيث بقعة واحدة (أو الحلقة) على مقربة من حافةيضيء الطائرة فتحة عدسة المجهر الهدف، بحيث قد تقع على ضوء العينة تحت زاوية Θ ≥ Θ C. لذلك، هناك حاجة إلى العدسات عالية الهدف فتحة تسمح مجموعة من حوالي 66-75 الزاوي °. ضبط للΘ زاوية، ومع ذلك، يتطلب تحولا محددة من الليزر التركيز على مسافة أقل من 100 ميكرون، والتي من الصعب القيام بها، حتى في المجهر TIRFM تجاريا. عيوب أخرى من فتحة عالية (تضخم عالية و) العدسات الهدف بالقرب من الميدان وتباين حقول كائن محدودة إلى حد ما. ولذلك، بالمقارنة مع الاجهزة TIRFM الهدف من نوع التجريبية كما هو موضح في هذه المخطوطة هي الأفضل لقياس الخلايا الركيزة طوبولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أشكر لاند ولاية بادن فورتمبيرغ والاتحاد فندق Europäischer Europäische فون FÜR يموت ENTWICKLUNG regionale - للحصول على تمويل ZAFH الفوتون N، الفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) لتمويل منحة بحثية لا. 1792C08 وكذلك شركة محدودة ولاية بادن فورتمبيرغ، ستيفتونغ لتمويل مشروع "Aurami".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator Nunc Nunc Cellstar
QM1300SVBA
Laminar flow Holten Safe S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin BIOCHROM Cultivation medium
Glass object slides Marienfeld Pure white glass Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) Molecular Probes Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope Carl Zeiss Axioplan 1
Laser diode PicoQuant LDH 400 with driver PDL 800-B Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system Point Source kineFlex Used with collimating optics
EMCCD camera Andor DV887DC Back illuminated camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
  2. Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
  3. Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
  4. Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).
  5. Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
  6. Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
  7. Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
  8. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
  11. Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
  12. Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
  13. Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
  14. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
  15. Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
  16. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  17. Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 68، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، الفيزياء الحيوية، الفيزياء، التصاق الخلية، المجهري مضان، TIRFM، nanotopology
Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M., Weber, P., Baumann, H.,… More

Wagner, M., Weber, P., Baumann, H., Schneckenburger, H. Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). J. Vis. Exp. (68), e4133, doi:10.3791/4133 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter