Nanotopology dell'adesione cellulare su angolo di inclinazione variabile Microscopia Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM)

Summary

Topologia di adesione cellulare su un substrato viene misurata con precisione nanometrica variabile-angolo microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (VA-TIRFM).

Abstract

Topologia superficiale, ad esempio di cellule che crescono su un substrato, è determinata con precisione nanometrica Variable-Angle Microscopy Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM). Cellule sono coltivate su vetrini trasparenti ed incubate con un marcatore fluorescente omogeneamente distribuiti nella loro membrana plasmatica. L'illuminazione avviene mediante un raggio laser parallelo sotto angoli variabili di riflessione interna totale (TIR) ​​con differenti profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente. Registrazione di immagini di fluorescenza upon irradiazione a circa 10 diverse angolazioni permette di calcolare cellula-substrato distanze con una precisione di pochi nanometri. Differenze di adesione tra varie linee cellulari, cellule tumorali e cellule es meno maligne, sono così determinato. Inoltre, eventuali modifiche di adesione cellulare su di trattamento chimico o fotodinamica può essere esaminato. In confronto con altri metodi di super-risoluzione microscopia luce di esposizione rimanedanni molto piccola, e non di cellule viventi ci si aspetta.

Introduction

Quando un fascio di luce che si propaga attraverso un mezzo di indice di rifrazione n ₁ incontra un'interfaccia ad un secondo mezzo di rifrazione n ₂ <n _1, riflessione interna totale avviene a tutti gli angoli di incidenza Θ, che sono maggiore dell'angolo critico Θ = _c arcsin (n ₂ / n _1). Nonostante sia totalmente riflesso del fascio di luce incidente evoca un campo evanescente elettromagnetico che penetra nel secondo mezzo e decade esponenzialmente con la distanza z perpendicolare dall'interfaccia secondo I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corrisponde all'intensità del campo elettromagnetico e d (Θ) alla profondità di penetrazione alla lunghezza d'onda λ, come indicato da

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Come riportato in letteratura ^1,2, I ₀ e moltiplicato per il coefficiente di trasmissione T (Θ) e il rapporto n ₂ / n _1. Se il vettore di campo elettrico di questo fascio di luce polarizzata è perpendicolare al piano di incidenza (cioè il piano attraversato dal incidente e il raggio riflesso), questo fattore di trasmissione è data dalla

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - ₍₂ n / NL ₁₎ ^2]

Per l'intensità di fluorescenza rilevata in misurazioni TIRFM, assorbimento di luce deve essere integrati su tutti gli strati del campione e moltiplicato per il rendimento η quantica di fluorescenza del colorante rilevante e con l'angolo solido di rilevamento Ω. Come riportato in precedenza ^3, questa intensità può essere descritto da

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

se tutti i fattori che sono indipendenti f rom l'angolo di incidenza e Θ coordinata z sono inclusi nella equazione sperimentale A. costante 3 può essere risolto analiticamente, se la concentrazione c (z) di fluorofori è considerato essere quasi costante

- O affatto coordinate z ≥ Δ, ad esempio all'interno del citoplasma delle cellule aventi una distanza Δ dall'interfaccia. In questo caso, l'integrale deve essere calcolata da z = Δ per z = ∞ conseguente

I _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- O tra z = Δ - t / 2 e z = + Δ t / 2, ossia in un sottile strato di spessore t, ad esempio una membrana cellulare a una distanza Δ dall'interfaccia. In questo caso, l'intensità di fluorescenza può essere calcolato come

I _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

se t è piccolo in confronto con Δ.

ent "> dalle equazioni (4) e (5) cellula-substrato distanze Δ può essere calcolato, se le immagini di fluorescenza I _F sono registrati per angoli variabili Θ, e se ln (I _F / T d) (Eq. 4) o ln (I _F / T) (Eq. 5) viene valutato come una funzione di 1 / d per questi angoli. Per la membrana marcatore laurdan impiegate in questo documento (vedi sotto), la valutazione è stata eseguita secondo l'Eq. 5.

Come riportato in precedenza ^3, l'acquisizione delle immagini e la valutazione richiede
- Distribuzione omogenea della luce di eccitazione sul campione,
- Validità di un 2-strato del modello (con gli indici di rifrazione n ₁ e n ₂ per il substrato e il citoplasma, rispettivamente). Ciò vale, se la membrana plasmatica è molto sottile, e se il livello del mezzo extracellulare (tra la cella e il substrato) è piccolo rispetto alla lunghezza d'onda della luce incidente.

Inoltre, un'apertura numerica moderata(Tipicamente A ≤ 0,90) della lente di obiettivo microscopio è vantaggioso per evitare deviazioni di luminosità dovuta alla anisotropia della radiazione nel campo vicino dell'interfaccia dielettrico.

Protocol

1. Semina ed incubazione di cellule

1. Seme singole cellule, per es U373-MG o U-251-MG cellule di glioblastoma ad una densità tipica di 100 cellule / mm ² su un vetrino e farle crescere per 4872 ore in terreno di coltura (per es RPMI 1640 integrato con 10% siero di vitello fetale e antibiotici) utilizzando un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Incubare le cellule con un marcatore di membrana, per esempio 6-dodecanoile dimetilammino-2-naftalene (laurdan) applicata per 60 minuti ad una concentrazione di 8 mM (in mezzo di coltura) ^4, o un marcatore citoplasma, ad esempio calceina acetomethlyester applicato per 40 min a concentrazione di 5 pM ^3, o una membrana associata fotosensibilizzatore, ad esempio protoporfirina IX indotta upon 4 ore di incubazione con il suo precursore acido 5-aminolevulinico (5-ALA; 1 mM) ^4,5.
3. Lavare le cellule con mezzo di coltura o tampone fosfato salino (PBS) prima di microscopia a fluorescenza. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Utilizzare un microscopio verticale, ad esempio Zeiss Axioplan, e sostituire il suo condensatore da un dispositivo di illuminazione, come descritto in rif. 3 con una emisferica o semicilindrica prisma di vetro accoppiato otticamente alla slitta oggetto (vedi Figura 1).
2. Utilizzano un fascio laser collimato parallelo che dopo l'imaging dal prisma di vetro e altri componenti ottici (ad es specchio concavo) risultati anche in un fascio parallelo sulla superficie del campione (raggio pupilla telecentrico). Fare attenzione che il vettore campo elettrico è perpendicolare alla polarizzata piano di incidenza.
3. Utilizzare uno specchio orientabile situato all'interno del condensatore che è ripreso nel piano campione e illumina il campione con un angolo di incidenza variabile (raggio oggetto). Lo specchio regolabile può essere azionato da un motore passo passo, dove ogni posizione corrisponde un angolo ben definito di incidenza, come determinato dalle misurazioni goniometriche ³
4. Calibrare la posizione angolare dello specchio regolabile utilizzando l'angolo critico Θ = 61,3 ° _C per un bicchiere di acqua transizione come valore fisso. Θ _c possono essere visualizzati al variare della Θ quando un colorante fluorescente (ad esempio, 1 mM flavina mononucleotide, FMN) è disciolto in acqua. La posizione dello specchio con Θ = Θ _c è memorizzato nel programma di posizionamento specchio.
5. Impostare i parametri della telecamera (retro illuminato Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Tecnologia, Belfast, Regno Unito ^6), tra cui la temperatura, il guadagno, il tempo di registrazione e la velocità di spostamento.
6. Utilizzare una lente obiettivo di ingrandimento adeguato e preferenzialmente moderata apertura numerica (per esempio 40 × / 0,75 o 63 × / 0,90 immersione in acqua) e localizzare la slitta oggetto nel microscopio. Usare olio di immersione per assicurarne il contatto con ottica del campione con il prisma di vetro. Registrare immagini di fluorescenza di campioni identici al variare dellaangolo di illuminazione (Θ ≥ Θ Θ _c con _c corrispondente a 64,5 ° per una cella di vetro interfaccia). Una gamma angolare di 66 ° -74 ° con passi di 0,5 ° o 1 ° è raccomandato. Utilizzare un adeguato passaggio lungo o filtro passa banda per il rilevamento di fluorescenza.

3. Analisi dei dati

1. Leggere le immagini (ad esempio in formato ASCII) registrate a vari angoli Θ, nonché le impostazioni della fotocamera per discriminazione (sfondo), la lunghezza d'onda di eccitazione e gli indici di rifrazione del vetro (n ₁ = 1,52) e cellule (n ₂ = 1,37) nel programma di valutazione (LabView, nanocellula). Per ogni set di parametri della profondità di penetrazione d (Θ) e la trasmissione fattore T (Θ) sono calcolati automaticamente.
2. Selezionare le immagini utilizzate per la valutazione della cellula-substrato distanze Δ secondo l'equazione 5 (marker di membrana) o equazione 4 (marcatore citoplasma), le immagini individuali con disomogeneailluminazione (e rivelatrice, g. strisce) possono essere esclusi.
3. Calcola le immagini di cellule-substrato topologia e selezionare un codice di colore appropriato per la visualizzazione. Durante profili di valutazione dei singoli pixel possono essere visualizzati, come illustrato nella Figura 2. Questi profili possono essere utilizzati come indicatore per la qualità della calzata.
4. Memorizzare il protocollo di valutazione.

4. Risultati rappresentativi

Esperimenti rappresentativi sono eseguite con tecniche di ingegneria genetica cellule di glioblastoma U251-MG gentilmente fornite dal Prof. Jan Mollenhauer, Dipartimento di Oncologia Molecolare, University of South Denmark, Odense. In due subcloni di tali cellule U251 geni oncosoppressori TP53 o PTEN sono sovra-espressi utilizzando un Tet-On sistema inducibile di espressione, in modo tale che queste cellule presentano un potenziale oncogeno ridotta e può essere considerato meno maligna. Altamente maligni U251-MG cellule senza gene soppressore vengono utilizzati come controlli, e U251-Cellule di tipo MG selvatici in carica per un ulteriore confronto. Un diodo laser che emette una serie quasi continua di impulsi picosecondi (LDH400 con conducente PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Germany, lunghezza d'onda: 391 nm; impulso di energia: 12 pJ; tasso di ripetizione: 40 MHz) è utilizzato come una sorgente di eccitazione.

Nella Figura 3 immagini TIRFM di U251-MG cellule di glioblastoma con un attivato TP53 gene soppressore del tumore e incubate con laurdan (8 uM, 60 min), sono raffigurati per gli angoli di incidenza di 66,0 °, 69,0 ° e 73,0 ° corrispondenti a profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente di circa 140 nm, 75 nm e 60 nm, rispettivamente. Con profondità decrescente fluorescenza penetrazione diminuisce di intensità (vedi tabelle) e proviene da altri siti superficiali delle cellule (ad esempio contatti focali sui bordi). Cell-substrato distanze (visualizzato in 3d figura da un codice colore che va 0-600 nm) fortemente variare nel corso del le celle comprese tra illy pochi nanometri (bianco-giallo) e 250-300 nm (rosso scuro), vale a dire i contatti focali e grandi cellule substrato distanze sono nelle immediate vicinanze. Lo stesso vale per U251-MG cellule di glioblastoma con un gene PTEN attivato soppressore (Figura 4d), ​​mentre la cellula-substrato distanze sono piuttosto costanti per U251-MG di controllo e cellule wild type con i valori tipici di 80-100 nm (giallo; Figura 4b ) e 150-200 nm (rosso-arancio; la figura 4a).

Figura 1. Dispositivo di illuminazione per VA-TIRFM in un microscopio verticale. Uno specchio orientabile comandata da un motore passo permette una risoluzione angolare di ± 0,25 °.

Figura 2. Profilo di valutazione per un pixel (schematica). Quando ln [I _F / T (Θ)] viene tracciata in funzione di 1 / d (Θ), rappresenta la pendenza della cellula-substrato distanza Δ. Tale pendenza è comunemente determinata con una precisione di circa ± 10%. Un valore - derivante dalla illuminazione disomogenea - è stata segnata ed esclusi dalla valutazione.

Figura 3 immagini TIRFM di U251-MG cellule di glioblastoma con attivata TP53 gene soppressore su incubazione con laurdan (8 uM, 60 min). Registrato a vari angoli di illuminazione (ac); cellula-substrato distanze nell'intervallo 0-600 nm mostrato da un codice colore (d); lunghezza d'onda di eccitazione: 391 nm, la rilevazione: ≥ 420 nm, dimensioni immagine: 210 micron. × 210 micron Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4 Cell-substrato distanze U251-MG cellule glioblatoma nell'intervallo 0-600 nm indicati da un codice colore,. (A) di tipo selvatico (b) i controlli, (c) cellule con attivata gene soppressore TP53, (d) cellule con attivato PTEN gene soppressore; lunghezza d'onda di eccitazione: 391 nm, la rilevazione: ≥ 420 nm, dimensioni immagine: 210 micron. × 210 micron Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Un metodo è descritto per cella di misura-substrato distanze con precisione nanometrica. Attualmente, i metodi di super-risoluzione microscopia, ad esempio sulla base di illuminazione strutturata ⁷ o ^8-10 singoli rilevazione molecola nonché deplezione emissione stimolata (STED) microscopia ¹¹ sono di notevole interesse. Nessuna di queste tecniche, tuttavia, consente una risoluzione assiale inferiore a 50 nm. Inoltre, irradianza piuttosto elevato di 50.100 W / cm ² è necessario per i metodi di singola molecola e più di 3000 W / cm ² per microscopia STED. Questo supera irraggiamento solare (circa 100 mW / cm ²⁾ di diversi ordini di grandezza, in modo che danno rapida cellule viventi è probabile che si verifichi. In VA-TIRFM esperimenti, tuttavia, irraggiamento può essere limitata a meno di 20 mW / cm ^2, che consente tempi di esposizione di diversi minuti o anche ore, senza alcun danno per le cellule viventi ^12, in modo che di lunga durata esperimenti con mulesposizioni gestire più appaiono ben possibile. Presupposti principali per ogni esperimento sono buone taratura angolare e l'illuminazione omogenea di diapositive oggetti puliti.

VA-TIRFM può essere applicata a vari argomenti relativi a superfici tecniche o biologiche, per esempio misurazioni di adesione cellulare ad un substrato trasparente. La crescita cellulare, la migrazione cellulare o morte cellulare (apoptosi esempio) può, pertanto, essere studiati più dettagliatamente. Recentemente, il ruolo del colesterolo intracellulare di adesione cellulare è stato esaminato ^4. In particolare, si è scoperto che il numero di cellula-substrato contatti è stato ridotto sulla riduzione del colesterolo del 3050%, infine conseguente distacco di un maggior numero di cellule da loro substrato. Adesione cellulare è stato studiato anche su istanza di fotosensibilizzatori comunemente utilizzati nella terapia fotodinamica (PDT) di cancro e altre malattie ^13. Si è scoperto che su di irradiazione con dosi non fototossiche luce cellula-substrato distanzesono stati leggermente ridotto (forse a causa di qualche gonfiore della cellula), mentre sono stati mantenuti adesioni focali ^4,5. Pertanto, la formazione di metastasi a causa PDT non era probabile. Esperimenti attuali mostrano differenze di adesione cellulare tra tumore (glioblastoma) e le cellule maligne meno. Solo i futuri esperimenti si dimostrerà se questo diverso comportamento può essere utilizzato per applicazioni diagnostiche, farmacologiche o terapeutico.

Va sottolineato che le misurazioni di cellule-substrato contatti risalgono agli inizi del microscopio TIRF ^14. Risoluzione angolare, tuttavia, necessario apparecchiature piuttosto complesso ^15, finora, e solo lo sviluppo di un dispositivo di illuminazione compatto per angolo variabile TIRFM ³ misurazioni di routine consentiti di cellula-substrato topologia. In aggiunta a questo tipo di prisma TIRFM, miniaturizzazione è stato introdotto da obiettivo-tipo TIRFM ^16,17, in cui un singolo punto (o anello) vicino al bordo diil piano di apertura della lente obiettivo microscopio è illuminato, in modo che la luce può cadere sul campione in un angolo Θ ≥ Θ _C. Pertanto, elevati obiettivi obiettivi aperture che consentono un campo angolare di circa 66-75 ° sono necessari. Ottimizzazione dell'angolo Θ, tuttavia, richiede uno spostamento definito del fuoco del laser ad una distanza inferiore a 100 micron, che è difficile da eseguire, anche in un microscopio TIRFM commercializzato. Ulteriori svantaggi di apertura alti (e ad alto ingrandimento) lenti dell'obiettivo sono anisotropia campo vicino e campi oggetto piuttosto limitate. Pertanto, in confronto con obiettivo di tipo setup TIRFM sperimentali come descritto in questo manoscritto sono preferibili per cella di misura-substrato topologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera