기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.
표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.
굴절률 N (1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N 2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 <N 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ C = arcsin (N 2 / N 1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I 0 EZ / D (Θ). I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당
D (Θ) = (λ/4π) (N 1 2 죄가 두 Θ – N 2 2) -1 / 2
문학 1,2에보고로서, 0 </sUB>는 I 이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N 2 / N 1 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기장 벡터가 입사 평면 (사건과 반사 빔이 사라지는 비행기 IE)에 편광 수직 인 경우,이 전송 요소가 주어집니다
T (Θ) = 4 왜냐하면이 Θ / [1 – (N 2 / NL 1) 2]
TIRFM 측정에서 검출 된 형광 강도를 들어, 광 흡수는 시료의 모든 레이어를 통해 통합과 관련 염료의 형광 양자 수율 η로뿐만 아니라 감지 Ω의 고체 각도 곱해야합니다. 이전에 3보고,이 강도는에 의해 설명 될 수있다
I F (Θ) = (Θ) OC (Z) AT 전자 Z / D (Θ) dz
경우 독립적 인 F있는 모든 요소 fluorophores의 농도 C (Z)이 거의 일정으로 간주되는 경우 ROM이 입사 각도 Θ과 좌표 Z는 실험 상수 A. 방정식 3에서 포함되어 있습니다이 analytically 해결 될 수
– 중 모든 좌표 Z ≥ Δ에서 인터페이스에서 거리 Δ을 갖는 세포의 세포질 내에서 지정할 수있다. 이 경우 적분은 Z = Δ부터 Z = ∞ 결과 계산해야합니다
I F = C T (Θ) D (Θ) E-Δ / D (Θ)
– 또는 Z 사이 = Δ – t / 2, Z = Δ + t / 2, 두께 t의 얇은 층 내에서 즉, 예를 들어 인터페이스에서 거리 Δ에있는 세포막. 이 경우 형광 강도는 다음과 같이 계산 될 수있다
I F = C T (Θ) 테-Δ / D (Θ),
t는 Δ에 비해 작은 경우.
이전 3, 이미지 수집보고 및 평가가 필요로
– 샘플을 여기 빛의 균일 한 분배,
– 2 층 모델 (기판과 세포질의 굴절 지수 N 1과 N 2, 각각)의 타당성. 플라즈마 막가 매우 얇은 경우이 보유하고 있으며, 세포 매체 (셀과 기판 사이)의 층은 입사광의 파장에 비해 작은 경우.
또한, 중간 수치 개구(일반적으로 ≤ 0.90) 현미경 대물 렌즈의는 유전체 인터페이스의 가까운 분야에서 방사선의 이방성에 의한 밝기의 편차를 방지하기 위해 바람직하다.
방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 7 일 또는 단일 분자 검출 8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 11 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다…
The authors have nothing to disclose.
저자는 나라 바덴 – 뷔 르템 베르크와 Europäische 연합 (EU) – Europäischer Fonds 모피 다이 regionale Entwicklung 감사합니다 – 자금 ZAFH – 광자 N, 아니 기금 연구 기금에 대한 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (BMBF)에. 1792C08뿐만 아니라 프로젝트 "Aurami"을 융자의 바덴 – 뷔 르템 베르크 – Stiftung GmbH가.
Name | Company | Type | Comments |
Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |