Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Summary

Bir substrat üzerindeki hücre adezyon Topolojisi değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle ölçülür.

Abstract

Yüzey topoloji, bir substrat üzerinde büyüyen hücrelerin örneğin, Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle belirlenir. Hücreler şeffaf slaytlar üzerinde ekili ve homojen onların plazma membranında dağıtılan bir floresan işaretleyici ile inkübe edilir. Aydınlatma yiten elektromanyetik alanın farklı nüfuz etme derinliği olan toplam iç yansıma (TIR) ​​değişken açılı altında paralel bir lazer ışını ile gerçekleşir. Yaklaşık 10 farklı açılarda ışınlaması üzerine floresans görüntülerinin kaydedilmesi birkaç nanometre hassasiyetle hücre yüzey mesafeleri hesaplamak için izin verir. Çeşitli hücre çizgileri, örneğin, kanser hücreleri ve daha az habis hücreleri arasında yapışma farklılıkları, bu şekilde tespit edilmektedir. Buna ek olarak, kimyasal ya da fotodinamik tedavi bağlı hücre yapışmasının olası değişiklikleri kontrol edilebilir. Süper-çözünürlük diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında mikroskopi ışığa maruz tutulurcanlı hücreler, çok küçük, ve herhangi bir hasar meydana beklenmektedir.

Introduction

Kırılma indisi n, ₁ arasında bir ortam içinden ilerleyen bir ışık ışını kırılma indisi n, _2, ikinci bir ortam bir ara yüz karşılaştığında <n _1, toplam iç yansıma kritik açı daha büyük olan oran Θ tüm açılar meydana gelir Θ _c = arcsin (n = ₂ / n _1). Tamamen yansıyan olmasına rağmen olay ışık demeti ben göre ikinci orta ve arabirimden dik mesafe z'nin katlanarak çürüklerini giren bir fani elektromanyetik alan çağrıştırıyor (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) olarak verilen, dalga boyu λ da penetrasyon derinliği ile elektromanyetik alan ve d (Θ) yoğunluğunu tekabül

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ – n ₂ ^{2) -1 / 2}

Literatürde ^1,2 bildirildiği kadarıyla, ben ₀ </sub> I _e iletim faktörü T (Θ) ve oranı n ₂ / n ₁ ile çarpılır olayla ışık yoğunluğuna karşılık gelir. Bu, ışının elektrik alan vektörü geliş düzlemine (olay ve yansıyan ışın tarafından yayılmış düzlemi yani) için polarize dik ise, bu iletim faktörü tarafından verilir

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (n = ₂ / nL ₁₎ ^2]

TIRFM ölçümleri de tespit edilen floresans yoğunluğu, ışık emme numune, tüm tabakaları üzerine entegre edilmiş ve ilgili boya floresans kuantum verimi ile η yanısıra algılama Ω katı açı ile çarpılarak gerekmektedir. ^3. Daha önce belirtildiği gibi, bu yoğunluk ile tanımlanabilir

Ben _F (Θ) = (Θ) OC (z) AT ^{E-z / d (Θ)} dz

Eğer bağımsız f tüm faktörler florofor konsantrasyon c (Z) hemen hemen sabit olduğu için kabul edilir ise ROM geliş açısı Θ ve koordinat z deneysel sabit A. Denklem 3 içinde yer alır, analitik olarak çözülebilir

– Ya da bütün koordinatlar z ≥ Δ de arayüzünden bir mesafe Δ sahip olan hücrelerinin sitoplazması içinde, örn. Bu durumda, tamamlayıcı z = Δ kadar z = ∞ elde olarak hesaplanmalıdır

Ben _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– Ya da z arasında = Δ – t / 2 ve z = Δ + T / 2, kalınlığı t, ince bir tabaka içinde, yani, örneğin, arayüz Δ bir mesafede bulunan bir hücre membranıdır. Bu durumda, floresan yoğunluğu olarak hesaplanabilir;

Ben _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

t Δ ile karşılaştırıldığında küçük ise.

floresans yoğunluğunu _{I, F} görüntü değişken açılı için kaydedilir ise Eşitlik (4) ve (5) hücre-yüzey mesafeleri ent "> Δ, hesaplanabilir Θ, ve eğer ln (I _F / T d) (denklem 4) ya da ln (I _F / T) (denklem 5) bu açılar için 1 / d'lik bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan zar işaretleyici laurdan (s. altında) için değerlendirme Denk. 5'e göre yapıldı.

Daha önce ^3, görüntü elde bildirdi ve değerlendirme gerektirdiğinden dolayı
– Numune üzerinde uyarma ışık homojen dağılımı,
– 2-katmanlı model (yüzey ve sitoplazma için kırılma indisleri n ₁ ve n ₂ ile, sırasıyla) geçerlilik. Plazma zar çok ince ise, bu, tutar, ve hücre dışı ortamda (hücre ile alt tabaka arasında) tabaka gelen ışığın dalga boyu ile karşılaştırıldığında küçük ise.

Buna ek olarak, bir orta açıklık sayısal(Tipik olarak A ≤ 0.90) mikroskop objektif lens dielektrik arayüz yakın alanına radyasyon anizotropi dolayı parlaklık sapmaları engellemek için avantajlıdır.

Protocol

1. Hücre Ekici ve Kuluçka Tohum tek tek hücreler, örneğin, U373-MG-251 ya da U-MG, glioblastoma hücrelerinin bir cam slayt üzerinde 100 hücre / mm 2 'tipik bir yoğunlukta ve (örneğin RPMI 1640 ve% 10 fetal dana serumu ile takviye kültür ortamı 4872 saat süreyle büyümelerini ve 37 bir inkübatör kullanarak antibiyotikler) ° C ve% 5 CO 2. Bir zar işaretleyici, örneğin 6-Dodekanoil-2-dimetilamino 8 uM (kültür ortamı, 4)<…

Discussion

Bir yöntem olup nanometre hassas hücre-yüzey uzunluk ölçmek için açıklanmıştır. Halen, süper-çözünürlük mikroskopi yöntemleri, örneğin yapılandırılmış aydınlatma ⁷ veya tek molekül saptama ^8-10 yanı sıra uyarılmış emisyon azalması (STED) mikroskopi ¹¹ hatırı sayılır bir ilgi vardır dayanmaktadır. Bu teknikler hiçbiri, yine de, 50 nm altındaki bir eksenel çözünürlüğe izin vermektedir. Buna ek olarak, 50100 arasında oldukça yüksek …

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera