Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanotopology af celleadhæsion ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Published: October 2, 2012 doi: 10.3791/4133
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Hochschule Aalen, Institut für Angewandte Forschung

Summary

Topologi af celleadhæsion på et substrat måles med nanometer præcision ved variabel vinkel total intern refleksion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM).

Abstract

Overflade topologi, fx af celler, der vokser på et substrat, bestemmes med nanometer præcision ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). Cellerne dyrkes på gennemsigtige objektglas og inkuberet med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembran. Belysning sker ved en parallel laserstråle under variable vinkler af total indre refleksion (TIR) ​​med forskellige indtrængningsdybder af det rumligt dæmpede elektromagnetiske felt. Optagelse af fluorescensbilleder ved bestråling ved omkring 10 forskellige vinkler tillader at beregne celle-substrat-afstande med en præcision på nogle få nanometer. Forskelle i adhæsion mellem forskellige cellelinier, fx cancerceller og mindre maligne celler, bestemmes således. Endvidere kan eventuelle ændringer i celleadhæsion ved kemisk eller fotodynamisk behandling undersøges. I sammenligning med andre metoder til super-opløsning mikroskopi lys eksponering holdesmeget lille, og ingen beskadigelse af levende celler forventes at forekomme.

Introduction

Når en lysstråle udbreder sig gennem et medium med brydningsindex n 1 møder en grænseflade til et andet medium af brydningsindeks n2 <n1, total intern refleksion forekommer i alle indfaldsvinkler Θ, som er større end den kritiske vinkel Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Trods bliver totalt reflekteret den indfaldende lysstråle fremkalder en rumligt dæmpede elektromagnetiske felt, der trænger ind i det andet medium og henfalder eksponentielt med vinkelrette afstand z fra grænsefladen ifølge I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) svarer til intensiteten af ​​det elektromagnetiske felt og d (Θ) til indtrængningsdybden ved bølgelængden λ, som givet ved

d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2

Som rapporteret i litteraturen 1,2, I 0 e ganget med transmissionen faktor T (Θ) og forholdet n 2 / n 1. Hvis det elektriske felt vektor af denne lysstråle er polariseret vinkelret på planet af forekomsten (dvs. planet udspændt af den indfaldende og den reflekterede stråle), er denne transmissionsfaktor givet ved

T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (N 2 / nL 1) 2]

For den detekterede fluorescens-intensitet i TIRFM målinger, har lysabsorption, der skal integreres over alle lag i prøven og multipliceret med fluorescens kvantumudbytte η af den pågældende farvestof og med topvinklen i detektion Ω. Som rapporteret tidligere 3, kan denne intensitet blive beskrevet ved

I F (Θ) = AT (Θ) nOC (Z) e-z / d (Θ) dz

hvis alle de faktorer, der er uafhængige f rom indfaldsvinklen Θ og koordinat z er indbefattet inden for eksperimentel konstant A. Ligning 3 kan løses analytisk, hvis koncentrationen c (z) af fluoroforer anses for at være næsten konstant

- Enten overhovedet koordinaterne z ≥ Δ, fx i cytoplasmaet af celler med en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde har integralet skal beregnes ud fra z = Δ til z = ∞ resulterer i

Jeg F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ)

- Eller mellem z = Δ - t / 2 og z = Δ + t / 2, dvs i et tyndt lag af tykkelsen t, fx en cellemembran beliggende i en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde kan fluorescensintensiteten beregnes som

Jeg F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ),

hvis t er lille i sammenligning med Δ.

ent "> Fra ligningerne (4) og (5) celle-substrat-afstande Δ kan beregnes, hvis billeder af fluorescensintensitet I F registreres for variable vinkler Θ, og hvis ln (I F / T d) (ligning 4) eller ln (I F / T) (ligning 5) vurderes som funktion af 1 / d for disse vinkler. For membranen markør laurdan anvendes i dette dokument (s, nedenfor) evalueringen blev udført ifølge ligning. fem.

Som rapporteret tidligere 3, image erhvervelse og evaluering kræver
- Homogen fordeling af excitationslyset over prøven,
- Gyldigheden af en 2-lags model (med brydningsindekserne n 1 og N2 i substratet og cytoplasmaet, henholdsvis). Dette gælder, når plasmamembranen er meget tynd, og hvis laget af det ekstracellulære medium (mellem cellen og substratet) er lille i forhold til bølgelængden for det indfaldende lys.

Endvidere kan en moderat numerisk apertur(Typisk A ≤ 0,90) af mikroskopet objektivlinsen er fordelagtigt at undgå afvigelser i lysstyrken på grund af anisotropi af stråling i den nærmeste område af det dielektriske grænseflade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Podning og inkubation af celler

  1. Seed individuelle celler, fx U373-MG eller U-251-MG glioblastoma-celler med en typisk densitet på 100 celler / mm 2 på et objektglas og dyrke dem i 4872 timer i dyrkningsmedium (fx RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum og antibiotika) ved anvendelse af en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Cellerne inkuberes med en membran markør, fx 6-dodecanoyl-2-dimethylamino-naphthalen (laurdan) påført i 60 minutter ved en koncentration på 8 uM (i dyrkningsmedium) 4, eller et cytoplasma markør, anvendes fx calcein acetomethlyester i 40 minutter ved en koncentration på 5 uM 3, eller et membranassocieret fotosensibilisator, f.eks protoporphyrin IX induceret efter 4 timers inkubering med dets precursor 5-aminolevulinsyre (5-ALA, 1 mM) 4,5.
  3. Vask cellerne med dyrkningsmedium eller phosphatbufret saltvand (PBS) forud for fluorescensmikroskopi. </ Li>

2. VA-TIRFM

  1. Brug en opretstående mikroskop, fx Zeiss Axioplan, og erstatte dets kondensator med en belysningsindretning, som beskrevet i ref. 3 med en hemi-sfærisk eller et hemi-cylindrisk glasprisme optisk koblet til objektet slide (se figur 1).
  2. Anvende en parallel kollimeret laserstråle, som efter billeddannelse ved glasprisme og yderligere optiske komponenter (f.eks hulspejl) igen resulterer i en parallel stråle på overfladen af prøven (telecentriske elev ray). Sørge for, at det elektriske feltvektor er polariseret vinkelret på planet af forekomsten.
  3. Brug en justerbar spejl placeret inde i kondensatoren, som er afbildet i prøveplanet og belyser prøven under en variabel indfaldsvinkel (objekt ray). Den indstillelige spejl kan drives af en stepmotor, hvor hver position svarer til en veldefineret indfaldsvinkel, som bestemt ved goniometric målinger 3.
  4. Kalibrere vinkelpositionen af den indstillelige spejl med den kritiske vinkel Θ c = 61,3 ° til en glas-vand-overgang som en fast værdi. Θ c kan visualiseres ved variation af Θ når et fluorescerende farvestof (fx 1 mM flavinmononucleotid, FMN) opløses i vand. Positionen af spejlet på Θ = Θ c lagres i spejlet positionering programmet.
  5. Indstil parametrene for kameraet (tilbage belyst Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, UK 6), herunder temperatur, forstærkning, optagetid og shift hastighed.
  6. Brug en objektiv linse passende forstørrelse og fortrinsvis moderat numerisk blænde (fx 40 × / 0,75 eller 63 × / 0,90 nedsænkning i vand) og lokalisere objektet slide i mikroskopet. Brug immersionsolie at sikre optisk kontakt af prøven med glasprisme. Optage fluorescensbilleder af identiske prøver ved variation afvinkel af belysning (Θ ≥ Θ c med Θ C svarende til 64,5 ° for en celle-glas Interface). Et vinkelområde på 66 ° -74 ° med trin på 0,5 ° eller 1 ° anbefales. Brug en passende lang aflevering eller band pass filter til fluorescenspåvisning.

3. Dataanalyse

  1. Aflæse billederne (fx i ASCII-format) i forskellige vinkler Θ samt de kameraindstillinger (for baggrundsdiskriminering), excitationsbølgelængden og brydningsindekset for glas (n 1 = 1,52) og celler (n2 = 1,37) i evalueringsprogrammet (LabView, NanoCell). For hvert sæt af parametre indtrængningsdybden d (Θ) og transmissionsfaktor T (Θ) beregnes automatisk.
  2. Vælg billeder, der bruges til vurdering af celle-substrat afstande Δ i henhold til ligning 5 (membran markør) eller ligning 4 (cytoplasma markør), Individuelle billeder med inhomogenbelysning (afslørende E, G. striber) kan udelukkes.
  3. Beregn billeder af celle-substrat topologi og vælge en passende farvekode til visning. Under evaluering profiler af enkelte pixel kan vises som vist i figur 2. Disse profiler kan anvendes som en indikator for kvaliteten af ​​pasningen.
  4. Gemme evalueringen protokollen.

4. Repræsentative resultater

Repræsentative forsøg udføres med gensplejsede U251-MG glioblastomceller venligt leveret af professor Jan Mollenhauer, afd. Molecular Oncology, University of South Danmark, Odense. I to subkloner af disse U251-celler af tumorsuppressorgener TP53 eller PTEN er overudtrykt under anvendelse af en Tet-On inducerbart ekspressionssystem, således at disse celler udviser et reduceret tumorigent potentiale og kan være mindre maligne. Højmalign U251-MG-celler uden suppressorgen anvendes som kontroller, og U251-MG vildtypeceller tjener til en yderligere sammenligning. En laser diode udsender en kvasi kontinuerlig række af picosekund pulser (LDH400 med chauffør PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Tyskland; bølgelængde: 391 nm, puls energi: 12 PJ, gentagelse rate: 40 MHz) anvendes som en excitationskilde.

I figur 3 TIRFM billeder af U251-MG glioblastom-celler med en aktiveret TP53 tumorsuppressorgen og inkuberet med laurdan (8 uM, 60 minutter) er afbildet for indfaldsvinkler af 66,0 °, 69,0 ° og 73,0 ° svarende til indtrængningsdybder af rumligt dæmpede elektromagnetiske felt på omkring 140 nm, 75 nm og 60 nm. Med aftagende indtrængningsdybde fluorescens aftaget i intensitet (se skalaer) og stammer fra mere overfladiske områder af cellerne (f.eks fokale kontakter på deres kanter). Celle-substrat-afstande (visualiseret i fig 3d med en farvekode der spænder fra 0 til 600 nm) kraftigt variere over cellerne mellem denly nogle få nanometer (hvid-gul) og 250-300 nm (mørk rød), dvs fokale kontakter og større celle-substrat afstande er i tæt nærhed. Det samme gælder for U251-MG glioblastom-celler med en aktiveret suppressorgen PTEN (Figur 4d), ​​mens celle-substrat-afstande er ret konstant i U251-MG kontrol og vildtypeceller med typiske værdier på 80 til 100 nm (gult, Figur 4b ) og 150-200 nm (orange-rød, figur 4a).

Figur 1
Figur 1. Belysningsindretning for VA-TIRFM i en opretstående mikroskop. Et justerbart spejl drives af en stepmotor tillader en vinkelopløsning på ± 0,25 °.

Figur 2
Figur 2. Evaluation profil for en pixel (skematisk). Når ln [I F / T (Θ)] er afbildet som funktion af 1 / d (Θ), hældningen repræsenterer celle-substrat distance Δ. Denne hældning er almindeligt bestemmes med en præcision på omkring ± 10%. Én værdi - som følge af inhomogen belysning - er blevet markeret og udelukket fra evalueringen.

Figur 3
Figur 3 TIRFM billeder af U251-MG glioblastom-celler med aktiverede TP53 suppressorgen efter inkubation med laurdan (8 uM, 60 minutter). Registreret ved forskellige indfalds (ac), celle-substrat-afstande i området fra 0 til 600 nm vist ved en farvekode (d); excitationsbølgelængde: 391 nm, afsløring: ≥ 420 nm, billedstørrelse:. 210 um × 210 um Klik her for at se større figur .


Figur 4 Cell-substrat-afstande på U251-MG glioblatoma celler i området fra 0 til 600 nm vist ved en farvekode,. (A) vildtype (b) kontrol, (C) celler med aktiverede suppressorgen TP53 (d) celler med aktiveret suppressorgen PTEN, excitationsbølgelængde: 391 nm, afsløring: ≥ 420 nm, billedstørrelse:. 210 um × 210 um Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der beskrives en fremgangsmåde til måling af celle-substrat-afstande med nanometer præcision. I øjeblikket metoder til super-opløsning mikroskopi, fx baseret på struktureret belysning 7 eller på enkelt molekyle detektion 8-10 samt stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi 11 er af betydelig interesse. Ingen af ​​disse teknikker er imidlertid, tillader en aksial opløsning under 50 nm. Desuden W / cm 2 ret høj bestråling på 50.100 er nødvendig for enkelt molekyle metoder og mere end 3.000 W / cm 2 for place mikroskopi. Dette overstiger solstråling (ca. 100 mW / cm 2) med flere størrelsesordener, så der hurtigt skader på levende celler er sandsynlig. I VA-TIRFM forsøg, dog kan bestråling begrænses til mindre end 20 mW / cm 2, hvilket tillader eksponeringstider på flere minutter eller endog timer uden nogen skade på levende celler 12, således at langvarige forsøg med mulmultiplum eksponeringer vises vel muligt. Vigtigste forudsætninger for hvert forsøg er gode kantet kalibrering og homogen belysning af rene objekt dias.

VA-TIRFM kan anvendes til mange forskellige emner relateret til tekniske eller biologiske overflader, fx målinger af celleadhæsion til en transparent underlag. Cellevækst, cellevandring eller celledød (f.eks apoptosis) kan derfor undersøges mere detaljeret. For nylig blev rollen af intracellulær cholesterol på celleadhæsion undersøgt 4. Især viste det sig, at antallet af celle-substrat-kontakt blev reduceret efter udtømning af kolesterol med 3050% endelig fører til frigørelse af et større antal celler fra deres substrat. Celleadhæsion blev ligeledes undersøgt ved anvendelse af fotosensibilisatorer almindeligvis anvendes i fotodynamisk terapi (PDT) af cancer og andre sygdomme 13. Det viste sig, at ved bestråling med ikke-fototoksiske lysdoser celle-substrat afstandeblev let reduceret (muligvis på grund af nogle hævelse af cellen), mens fokale adhæsioner blev opretholdt 4,5. Derfor dannelsen af ​​metastaser på grund af PDT var ikke sandsynligt. Foreliggende eksperimenter viser forskelle i celleadhæsion mellem tumor (glioblastoma) og mindre maligne celler. Kun fremtidige eksperimenter vil vise, om denne anden adfærd kan anvendes til diagnostiske, farmakologiske eller terapeutiske applikationer.

Det skal understreges, at målinger af celle-substrat kontakter dateres tilbage til begyndelsen af TIRF mikroskopi 14. Vinkelopløsning imidlertid behov for temmelig komplekse udstyr 15, indtil nu, og kun at udvikle en kompakt belysningsindretning med variabel vinkel TIRFM 3 tilladte rutinemæssige målinger af celle-substrat topologi. Ud over denne prisme-type TIRFM blev miniaturisering indført ved objektiv-typen TIRFM 16,17, hvor en enkelt plet (eller ringformede) tæt på kanten afDen aperturplanet af mikroskopet objektivlinsen lyser, således at lyset kan falde ned på prøven under en vinkel Θ ≥ Θ C. Derfor er en høj blænde objektivlinser muliggør et vinkelområde på ca 66-75 ° behov. Tuning af vinklen Θ kræver imidlertid en defineret forskydning af laser fokus inden for en afstand på mindre end 100 um, hvilket er vanskeligt at udføre, selv i en kommercialiseret TIRFM mikroskop. Yderligere ulemper ved høj blænde (og stor forstørrelse) objektivlinser er nær felt anisotropi og temmelig begrænsede objekt felter. Derfor, i sammenligning med mål-type TIRFM forsøgsopstillinger som beskrevet i dette manuskript foretrækkes til måling af celle-substrat topologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne takker delstaten Baden-Württemberg og Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - til finansiering ZAFH-PHOTON n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) for finansiering af forskning tilskud no. 1792C08 samt Baden-Württemberg-Stiftung GmbH til finansiering af projektet "Aurami".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator Nunc Nunc Cellstar
QM1300SVBA
Laminar flow Holten Safe S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin BIOCHROM Cultivation medium
Glass object slides Marienfeld Pure white glass Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) Molecular Probes Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope Carl Zeiss Axioplan 1
Laser diode PicoQuant LDH 400 with driver PDL 800-B Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system Point Source kineFlex Used with collimating optics
EMCCD camera Andor DV887DC Back illuminated camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
  2. Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
  3. Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
  4. Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).
  5. Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
  6. Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
  7. Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
  8. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
  11. Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
  12. Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
  13. Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
  14. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
  15. Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
  16. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  17. Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).

Tags

Bioengineering Cellular Biology Molecular Biology Biofysik Fysik Celleadhæsion fluorescensmikroskopi TIRFM nanotopology
Nanotopology af celleadhæsion ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M., Weber, P., Baumann, H.,… More

Wagner, M., Weber, P., Baumann, H., Schneckenburger, H. Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). J. Vis. Exp. (68), e4133, doi:10.3791/4133 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter