Nanotopology av celladhesion vid rörlig Vinkel total inre reflektion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Summary

Topologi av celladhesion på ett substrat mäts med nanometer precision genom variabel vinkel total inre reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM).

Abstract

Yta topologi, t.ex. av celler som växer på ett substrat, bestäms med nanometer precision genom variabel-Vinkel total intern reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM). Celler odlas på transparenta objektglas och inkuberas med en fluorescerande markör homogent fördelade i deras plasmamembran. Belysning sker genom en parallell laserstråle under varierande vinklar av total intern reflektion (TIR) ​​med olika inträngningsdjup av det evanescenta elektromagnetiska fältet. Registrering av fluorescensbilder vid bestrålning vid ca 10 olika vinklar medger att beräkna cell-substrat avstånd med en precision av några nanometer. Skillnader i vidhäftning mellan olika cellinjer, t.ex. cancerceller och mindre maligna celler, är sålunda bestämda. Dessutom, kan eventuella förändringar av celladhesion vid kemisk eller fotodynamisk behandling undersökas. I jämförelse med andra metoder för super-upplösning mikroskopi ljusexponering hållsmycket liten, och ingen skada av levande celler förväntas ske.

Introduction

När en ljusstråle som utbreder sig genom ett medium av brytningsindex n ₁ möter ett gränssnitt till ett andra medium med brytningsindex n ₂ <n _1, sker total inre reflektion vid alla infallsvinklar Θ, som är större än den kritiska vinkeln Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Trots att totalreflekteras den infallande ljusstrålen framkallar ett evanescent elektromagnetiskt fält som tränger in i den andra mediet och sönderfaller exponentiellt med vinkelräta avståndet z från gränsytan enligt I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) motsvarar intensiteten hos det elektromagnetiska fältet och d (Θ) till inträngningsdjupet vid våglängden λ, som ges av

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

Som rapporterats i litteraturen ^1,2, ₀ jag e multiplicerat med transmissionen faktor T (Θ) och förhållandet N ₂ / N _1. Om den elektriska fältvektorn av denna ljusstråle är polariserat vinkelrätt mot infallsplanet (dvs. planet överbryggas av den infallande och den reflekterade strålen), är denna överföring faktor ges av

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (N ₂ / nL ₁₎ ^2]

För den detekterade fluorescensintensiteten i TIRFM mätningar, måste Ijusabsorption ska integreras över alla skikten i provet och multipliceras med fluorescens kvantutbytet η av den relevanta färgämnet liksom med den fasta vinkeln för detektering Ω. Som tidigare rapporterats ^3, kan denna intensitet beskrivas genom

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

om alla faktorer som är oberoende f rom infallsvinkeln Θ och koordinaten z ingår i den experimentella konstanta A. Ekvation 3 kan lösas analytiskt, om koncentrationen C (Z) av fluoroforer anses vara nästan konstant

- Antingen vid alla koordinater z ≥ Δ, t.ex. inom cytoplasman i celler som har ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, måste integralen beräknas från z = Δ till z = ∞ resulterar i

I _F = A K T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Eller mellan z = Δ - t / 2 och z = Δ + t / 2, dvs inom ett tunt skikt av tjocklek t, t.ex. ett cellmembran belägen på ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, kan fluorescensintensiteten beräknas som

I _F = A K T (Θ) ^{TE-Δ / d (Θ)}

Om t är liten i jämförelse med Δ.

ENT "> Från ekvationerna (4) och (5) cell-substrat avstånd Δ kan beräknas, om bilder av fluorescensintensitet I _F registreras för variabla vinklar Θ och om ln (I _F / T d) (Ekv. 4) eller ln (I _F / T) (Ekv. 5) utvärderas som en funktion av 1 / d för dessa vinklar. För membran markören laurdan används i detta dokument (s. nedan) Utvärderingen utfördes enligt Ekv. 5.

Som tidigare rapporterats ^3, bild förvärv och utvärdering kräver
- Homogen fördelning av excitationsljus över provet,
- Giltigheten av en 2-lagers modell (med brytningsindex n ₁ och n ₂ för substratet och cytoplasman, respektive). Detta gäller, om plasmamembranet är mycket tunn, och om skiktet av det extracellulära mediet (mellan cellen och substratet) är liten jämfört med våglängden hos infallande ljus.

Dessutom, en måttlig numerisk apertur(Typiskt A ≤ 0,90) i mikroskopet objektiv är fördelaktigt att undvika avvikelser i ljusstyrka beroende på anisotropi av strålning i närområdet av den dielektriska gränssnittet.

Protocol

1. Sådd och inkubering av celler

1. Seed individuella celler, t.ex. U373-MG eller U-251-MG-celler glioblastom vid en typisk densitet av 100 celler / mm ² på en glasskiva och odla dem för 4872 timmar i odlingsmedium (t.ex. RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum och antibiotika) med användning av en inkubator vid 37 ° C och 5% COj _2.
2. Inkubera cellerna med ett membran markör, t.ex. 6-dodekanoyl-2-dimetylamino-naftalen (laurdan) tillämpas för 60 min vid en koncentration av 8 | iM (i odlingsmedium) ^4, eller ett cytoplasma markör, appliceras t.ex. kalcein acetomethlyester under 40 minuter vid en koncentration av 5 pM ^3, eller ett membranassocierat fotosensibiliserare, t.ex. protoporfyrin IX induceras vid 4 timmars inkubering med dess prekursor 5-aminolevulinsyra (5-ALA, 1 mM) ^4,5.
3. Tvätta cellerna med odlingsmedium eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före fluorescensmikroskopi. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Använd en upprätt mikroskop, t.ex. Zeiss Axioplan, och ersätta sin kondensor av en belysningsanordning, som beskrivs i Ref. 3 med en halvsfärisk eller en halvcylindrisk glasprisma optiskt kopplad till objektet sliden (se figur 1).
2. Använd en parallell kollimerad laserstråle som efter avbildning av glasprisma och ytterligare optiska komponenter (t.ex. konkav spegel) återigen resulterar i en parallell stråle på ytan av provet (telecentriska elev stråle). Se till att den elektriska fältvektorn är polariserad vinkelrätt mot infallsplanet.
3. Använd en justerbar spegel belägen inuti kondensorn som avbildas i preparatplanet och belyser provet under en variabel infallsvinkel (objektets stråle). Den justerbara spegeln kan drivas av en stegmotor, där varje position motsvarar en väl definierad infallsvinkel, såsom bestämdes genom mätningar goniometrisk ³
4. Kalibrera vinkelläget av den justerbara spegeln med den kritiska vinkeln Θ _c = 61,3 ° för en glas-vatten övergång som ett fast värde. Θ _c kan visualiseras vid variation av Θ när ett fluorescerande färgämne (t.ex. 1 mM flavinmononukleotid, FMN) löses i vatten. Positionen av spegeln vid Θ = Θ _c lagras i spegeln positioneringsprogrammet.
5. Ställ in parametrarna för kameran (tillbaka upplysta Andor IXON EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Storbritannien ^6), inklusive temperatur, förstärkning, inspelningstid och skift hastighet.
6. Använd ett objektiv med lämplig förstoring och företrädesvis måttlig numerisk bländare (t.ex. 40 × / 0,75 eller 63 × / 0,90 nedsänkning i vatten) och lokalisera objektet bilden i mikroskopet. Använd immersionsolja att säkerställa optisk kontakt av provet med glasprisma. Spela fluorescensbilder av identiska prover vid variation avbelysningsvinkel (Θ ≥ Θ _c med Θ _c motsvarande 64,5 ° för en cell-glas Interface). Ett vinkelområde av 66 ° -74 ° med steg om 0,5 ° eller 1 ° rekommenderas. Använd en lämplig lång passning eller bandpassfilter för fluorescensdetektion.

3. Dataanalys

1. Läs bilderna (t.ex. i ASCII-format) som tagits i olika vinklar Θ, samt kamerainställningar (för bakgrund diskriminering), excitationsvåglängden och brytningsindex för glas (n ₁ = 1,52) och celler (n ₂ = 1,37) i utvärderingsprogrammet (LabView, nanocell). För varje uppsättning parametrar inträngningsdjupet d (Θ) och transmissionen faktor T (Θ) beräknas automatiskt.
2. Välj bilder som används för utvärdering av cell-substrat avstånd Δ enligt ekvation 5 (membran markör) eller ekvation 4 (cytoplasma markör), Enskilda bilder med inhomogenbelysning (avslöjande e, g. ränder) kan uteslutas.
3. Beräkna bilder av cell-substrat topologi och välj en lämplig färgkod för visning. Under utvärdering profiler av enskilda pixlar kan visas, såsom visas i figur 2. Dessa profiler kan användas som en indikator för kvaliteten på passform.
4. Förvara utvärderingen protokollet.

4. Representativa resultat

Representativa experimenten utförs med genetiskt modifierade U251-MG glioblastomceller vänligt levereras av professor Jan Mollenhauer, Institutionen för molekylär onkologi, University of South Denmark, Odense. I två subkloner av dessa U251 celler är tumörsuppressorgener TP53 eller PTEN är överuttrycks användning av en Tet-On inducerbart uttryckssystem, så att dessa celler uppvisar en reducerad tumörframkallande potential och kan betraktas som mindre maligna. Mycket maligna U251-MG-celler utan suppressor-genen användes som kontroller, och U251-MG vildtypsceller tjänar för ytterligare jämförelse. En laserdiod som avger ett kvasi kontinuerlig serie av pikosekund pulser (LDH400 med förare PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Tyskland, våglängd: 391 nm, pulsenergi: 12 pj, repetitionshastighet: 40 MHz) används som exciteringskälla.

I figur 3 TIRFM bilder på U251-MG glioblastomceller med en aktiverad TP53 tumörsuppressorgen och inkuberas med laurdan (8 M, 60 min) skildras för infallsvinklar på 66,0 °, 69,0 ° och 73,0 ° motsvarande penetration djup evanescenta elektromagnetiskt fält av ca 140 nm, 75 nm och 60 nm, respektive. Med minskande fluorescens penetrationsdjup minskar i intensitet (se skalor) och härstammar från mer ytliga områden av cellerna (t.ex. fokala kontakter på deras kanter). Cell-substrat avstånd (visualiseras i fig 3d med en färgkod som sträcker från 0 till 600 nm) variera kraftigt över cellerna mellan påly några nanometer (vit-gul) och 250-300 nm (mörkröd), dvs fokala kontakter och större cell-substrat avstånd är i närheten. Detsamma gäller för U251-MG glioblastomceller med en aktiverad suppressorgen PTEN (figur 4d), ​​medan cell-substrat avstånden är ganska konstant för U251-MG kontroll och vilda celler typ med typiska värden på 80-100 nm (gult, figur 4b ) och 150-200 nm (orange-röd, Figur 4a).

Figur 1. Belysningsanordning för VA-TIRFM i upprätt mikroskop. En justerbar spegel som drivs av en stegmotor möjliggör en vinkelupplösning ± 0,25 °.

Figur 2. Utvärdering profil för en pixEl (schema). När LN [I _F / T (Θ)] plottas som en funktion av 1 / d (Θ), representerar lutningen cell-substrat avstånd Δ. Denna lutning är vanligtvis bestäms med en noggrannhet av ca ± 10%. Ett värde - till följd av inhomogen belysning - har märkts och uteslutas från utvärderingen.

Figur 3 TIRFM bilder av U251-MG glioblastomceller med aktiverad TP53 suppressorgen vid inkubering med laurdan (8 iM, 60 min). Registrerades vid olika infalls (ac), cell-substrat-avstånd inom intervallet 0-600 nm visas med en färgkod (d), exciteringsvåglängd: 391 nm, detektion: ≥ 420 nm, bildstorlek:. 210 nm × 210 nm Klicka här för att se större bild .

Figur 4 Cell-substrat avstånd U251-MG glioblatoma celler i intervallet 0-600 nm, som visas med en färgkod,. (A) vildtyp (b) kontroller, (c) celler med aktiverade suppressorgen TP53, (d) celler med aktiverad suppressorgen PTEN, exciteringsvåglängd: 391 nm, detektion: ≥ 420 nm, bildstorlek:. 210 nm × 210 nm Klicka här för att se större bild .

Discussion

En metod beskrivs för att mäta cell-substrat avstånd med nanometer precision. För närvarande metoder för super-upplösning mikroskopi, t.ex. baserade på strukturerade belysningen ⁷ eller på enstaka molekyl upptäckt ^8-10 samt stimulerad emission utarmning (Sted) mikroskopi ¹¹ är av stort intresse. Ingen av dessa tekniker tillåter emellertid en axiell upplösning under 50 nm. Dessutom W / cm ² ganska hög irradians av 50.100 behövs för enda molekyl metoder och mer än 3.000 W / cm ² för Sted mikroskopi. Detta överstiger solstrålningen (ca 100 mW / cm ²⁾ med flera storleksordningar, så att snabba skador på levande celler kan inträffa. I VA-TIRFM experiment, emellertid, kan strålningen begränsas till mindre än 20 mW / cm ^2, vilket tillåter exponeringstider av flera minuter eller tom timmar utan någon skada på levande celler ^12, så att långvariga experiment med multiple exponeringar visas väl möjligt. Viktigaste förutsättningarna för varje experiment är bra vinkel kalibrering och homogen belysning av rena objekt diabilder.

VA-TIRFM kan tillämpas på många frågor som rör tekniska eller biologiska ytor, t.ex. mätningar av celladhesion till ett transparent substrat. Celltillväxt, cellmigration eller celldöd (t.ex. apoptos) kan därför studeras mer i detalj. Nyligen har den roll som intracellulär kolesterol på celladhesion undersöktes ^4. I synnerhet visade det sig att antalet cell-substratkontakter reducerades vid utarmning av kolesterol med 3050%, slutligen leder till lösgöring av ett större antal celler från sina substrat. Celladhesion studerades också vid applicering av fotosensibiliserande vanligen används i fotodynamisk terapi (PDT) av cancer och andra sjukdomar ^13. Det visade sig att vid bestrålning med icke-fototoxiska ljusdoser cell-substrat avståndvar något reducerad (möjligen på grund av viss svallning av cellen), medan fokala adhesioner hölls ^4,5. Därför var bildandet av metastaser grund PDT osannolik. Nuvarande experiment visar skillnader i celladhesion mellan tumör (glioblastom) och mindre maligna celler. Endast framtida experiment kommer att visa om detta annorlunda beteende kan användas för diagnostiska, farmakologiska eller terapeutiska tillämpningar.

Det bör understrykas att mätningar av cell-substrat kontakter går tillbaka till början av TIRF mikroskopi ^14. Vinkelupplösning, krävs dock ganska komplicerad utrustning ^15, hittills, och endast utvecklingen av en kompakt belysningsanordningen för variabel vinkel TIRFM tillåten ³ rutinmässiga mätningar av cell-substrat topologi. Utöver detta prisma typ TIRFM var miniatyrisering introducerades av objektiv typ TIRFM ^16,17, där en enda fläck (eller ring) nära kantenöppningen plan mikroskopets objektivlins belyses, så att ljus kan falla på provet under en vinkel Θ ≥ Θ _C. Därför är höga bländare objektiv tillåter ett vinkelområde av ca 66-75 ° som behövs. Tuning av vinkeln Θ kräver emellertid en definierad förskjutning av lasern fokus inom ett avstånd av mindre än 100 | im, vilket är svårt att utföra, även i en kommersialiserad TIRFM mikroskop. Ytterligare nackdelar med hög bländare (och hög förstoring) objektiv är nära fältet anisotropi och ganska begränsade områden objekt. Därför, i jämförelse med objektiv typ TIRFM experimentella uppställningar som beskrivs i detta manuskript är att föredra för mätcell-substrat topologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera