Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Summary

Topología de la adhesión celular sobre un sustrato se mide con una precisión nanométrica de ángulo variable total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM).

Abstract

Topología de la superficie, por ejemplo de células que crecen sobre un sustrato, se determina con una precisión nanométrica de ángulo variable total Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna (VA-TIRFM). Las células se cultivan en portaobjetos transparentes y se incubaron con un marcador fluorescente distribuido homogéneamente en su membrana plasmática. Iluminación se produce mediante un rayo láser paralelo bajo ángulos variables de reflexión interna total (TIR) ​​con diferentes profundidades de penetración del campo electromagnético evanescente. Grabación de imágenes de fluorescencia tras la irradiación en alrededor de 10 diferentes ángulos permite calcular distancias sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. Las diferencias de adhesión entre las distintas líneas celulares, por ejemplo células cancerosas y las células malignas, son menos así determinada. Además, los posibles cambios de la adhesión celular a un tratamiento químico o fotodinámica puede ser examinado. En comparación con otros métodos de super-resolución exposición microscopía de luz se mantienedaño muy pequeño, y no de las células vivas se espera que ocurra.

Introduction

Cuando un haz de luz que se propaga a través de un medio de índice de refracción n ₁ cumple una interfaz a un segundo medio de índice de refracción n ₂ <n _1, la reflexión interna total se produce en todos los ángulos de incidencia Θ, que son mayores que el ángulo crítico _c = Θ arcsen (n ₂ / n _1). A pesar de estar totalmente reflejada del haz de luz incidente evoca un campo electromagnético evanescente que penetra en el segundo medio y decae exponencialmente con la distancia perpendicular z desde la interfaz de acuerdo a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde a la intensidad del campo electromagnético y d (Θ) a la profundidad de penetración en la longitud de onda λ, como se da

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sen ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Como se informó en la literatura ^1,2, I ₀ e multiplica por el factor de transmisión T (Θ) y la relación n ₂ / n _1. Si el vector de campo eléctrico de este haz de luz es polarizada perpendicular al plano de incidencia (es decir, el plano generado por el incidente y el rayo reflejado), este factor de transmisión está dada por

T (Θ) = 4 cos Θ ² / [1 - ₍₂ n / nL ₁₎ ^2]

Por la intensidad de fluorescencia detectada en mediciones TIRFM, absorción de la luz tiene que ser integrado en todas las capas de la muestra y multiplicado con el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante η pertinente, así como con el ángulo sólido de detección Ω. Como se informó previamente ^3, esta intensidad puede ser descrito por

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

si todos los factores que son independientes f rom el ángulo de incidencia Θ y la coordenada z se incluyen dentro de la ecuación experimental A. constante 3 se pueden resolver analíticamente, si la concentración de c (z) de los fluoróforos se considera que es casi constante

- Bien en todas las coordenadas z ≥ Δ, por ejemplo, en el citoplasma de las células que tienen una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la integral tiene que ser calculado de z = Δ para z = ∞ resulta en

I _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- O entre z = Δ - t / 2 y z = Δ + t / 2, es decir, dentro de una capa fina de espesor t, por ejemplo, una membrana de célula que se encuentran a una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la intensidad de fluorescencia puede ser calculada como

I _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

si t es pequeño en comparación con Δ.

ent "> De las ecuaciones (4) y (5) las distancias sustrato de células-Δ se puede calcular, si las imágenes de la intensidad de fluorescencia I _F se registran para ángulos variables Θ, y si ln (I _F / T d) (Ec. 4) o ln (I _F / T) (Ec. 5) se evalúa como una función de 1 / d para estos ángulos. Para la membrana marcador laurdan utiliza en este documento (s. a continuación) la evaluación se realizó de acuerdo a la ecuación. 5.

Como se informó anteriormente ^3, adquisición de imágenes y requiere una evaluación
- Distribución homogénea de la luz de excitación sobre la muestra,
- Validez de un modelo 2-capa (con los índices de refracción N ₁ y N ₂ para el sustrato y el citoplasma, respectivamente). Esto es, si la membrana plasmática es muy delgada, y si la capa del medio extracelular (entre la célula y el sustrato) es pequeño comparado con la longitud de onda de la luz incidente.

Además, una apertura numérica moderada(Típicamente un 0,90 ≤) de la lente objetivo del microscopio es ventajoso para evitar desviaciones de brillo debido a la anisotropía de la radiación en el campo cerca de la interfaz dieléctrico.

Protocol

1. Siembra y la incubación de células

1. Se siembran las células individuales, por ejemplo U373-MG o U-251-MG células de glioblastoma a una densidad típica de 100 células / mm ² sobre un portaobjetos de vidrio y crecer para 4872 hr en medio de cultivo (por ejemplo, RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y antibióticos), utilizando una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.
2. Se incuban las células con un marcador de membrana, por ejemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan) aplicada durante 60 min a una concentración de 8 M (en medio de cultivo) ^4, o un marcador de citoplasma, por ejemplo calceína acetomethlyester aplicado durante 40 min a una concentración de 5 mM ^3, o un fotosensibilizador asociado a la membrana, por ejemplo, la protoporfirina IX inducida tras la incubación de 4 horas con su precursor ácido 5-aminolevulínico (5-ALA; 1 mM) ^4,5.
3. Lavar las células con medio de cultivo o tampón fosfato salino (PBS) antes de la microscopía de fluorescencia. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Usar un microscopio vertical, por ejemplo, Zeiss Axioplan, y sustituir su condensador por un dispositivo de iluminación, como se describe en la ref. 3 con un semiesférica o un prisma de vidrio hemi-cilíndrica acoplada ópticamente a la corredera objeto (véase la Figura 1).
2. Utilice un haz colimado láser paralelo que después de la impresión por el prisma de vidrio y otros componentes ópticos (por ejemplo espejo cóncavo) vuelve a producirse en un haz paralelo en la superficie de la muestra (rayo telecéntrico alumno). Tener cuidado de que el vector de campo eléctrico es polarizada perpendicular con el plano de incidencia.
3. Use un espejo ajustable situado en el interior del condensador que se forma la imagen en el plano de muestra y se ilumina la muestra bajo un ángulo variable de incidencia (rayos objeto). El espejo ajustable puede ser accionado por un motor paso a paso, donde cada posición corresponde a un ángulo bien definido de incidencia, tal como se determina por medidas goniométricas ³
4. Calibrar la posición angular del espejo ajustable mediante el ángulo crítico Θ = 61,3 ° _C para una transición vidrio-agua como un valor fijo. Θ _c puede ser visualizado en la variación de Θ cuando un colorante fluorescente (por ejemplo, 1 mM mononucleótido de flavina, FMN) se disuelve en agua. La posición del espejo a Θ = Θ _C se almacena en el programa de posicionamiento espejo.
5. Establezca los parámetros de la cámara (de nuevo iluminado Andor Ixon EMCCD, DV887DC, Andor Technology, Belfast, Reino Unido ^6), incluyendo la temperatura, el aumento de tiempo de grabación y la velocidad de desplazamiento.
6. Utilice una lente de objetivo de ampliación adecuada y apertura numérica preferentemente moderada (por ejemplo 40 × / 0,75 o 63 × / 0,90 inmersión en agua) y localizar el portaobjetos en el microscopio. Usar aceite de inmersión para asegurar un contacto óptica de la muestra con el prisma de vidrio. Grabar imágenes de fluorescencia de muestras idénticas en la variación de laángulo de iluminación (Θ ≥ Θ Θ _c con _c correspondiente a 64,5 ° para una interfaz de celda de vidrio). Un intervalo angular de 66 ° -74 ° con pasos de 0,5 º o 1 se recomienda. Utilice un pase largo adecuado o filtro de paso de banda para la detección de fluorescencia.

3. Análisis de Datos

1. Leer las imágenes (por ejemplo, en formato ASCII) registrados en varios ángulos Θ, así como los ajustes de la cámara (para la discriminación de fondo), la longitud de onda de excitación y los índices de refracción de vidrio (n ₁ = 1,52) y células (n = ₂ 1,37) en el programa de evaluación (LabView; nanocélula). Para cada conjunto de parámetros de la profundidad de penetración d (Θ) y el factor de transmisión T (Θ) se calculan automáticamente.
2. Seleccione las imágenes utilizadas para la evaluación de las distancias de sustrato de células Δ acuerdo con la ecuación 5 (marcador de membrana) o la ecuación 4 (marcador citoplasma), las imágenes individuales con inhomogéneailuminación (e reveladora, rayas g.) pueden ser excluidos.
3. Cálculo de las imágenes de topología célula-sustrato y seleccione un código de color apropiado para la exhibición. Durante la evaluación de los perfiles de los píxeles individuales se puede mostrar, tal como se representa en la Figura 2. Estos perfiles pueden ser utilizados como un indicador de la calidad del ajuste.
4. Guarde el protocolo de evaluación.

4. Los resultados representativos

Experimentos representativos se llevó a cabo con ingeniería genética células de glioblastoma U251-MG amablemente proporcionados por el Prof. Jan Mollenhauer, Departamento de Oncología Molecular de la Universidad del Sur de Dinamarca, Odense. En dos de estos subclones células U251 los genes supresores de tumores TP53 o PTEN están sobre-expresa con un Tet-On sistema de expresión inducible, de tal manera que estas células presentan un potencial oncogénico reducido y puede ser considerado como menos maligno. Altamente maligno U251-MG células sin gen supresor se usan como controles, y-U251MG células de tipo salvaje servir para una comparación más. Un diodo láser que emite una serie casi continua de impulsos de picosegundos (LDH400 con controlador PDL 800-B, Picoquant, Berlín, Alemania; longitud de onda: 391 nm; energía de pulso: 12 pJ; tasa de repetición: 40 MHz) se utiliza como una fuente de excitación.

En la figura 3 imágenes TIRFM de U251-MG células de glioblastoma con un gen supresor de tumor activado TP53 y se incubaron con laurdan (8 micras; 60 min) se representan para ángulos de incidencia de 66,0 °, 69,0 ° y 73,0 ° correspondientes a profundidades de penetración de la campo electromagnético evanescente de alrededor de 140 nm, 75 nm y 60 nm, respectivamente. Con la disminución de la fluorescencia de profundidad de penetración disminuye en intensidad (véase escalas) y se origina en más sitios superficiales de las células (por ejemplo, contactos focales sobre sus bordes). Sustrato celular distancias (visualizado en la figura 3d por un código de color que va desde 0 hasta 600 nm) varían fuertemente en las células entre elly unos pocos nanómetros (blanco-amarillo) y 250-300 nm (rojo oscuro), es decir, los contactos focales y las grandes distancias sustrato de células se encuentran en las cercanías. Lo mismo vale para U251-MG células de glioblastoma con un gen supresor PTEN activado (Figura 4d), ​​mientras que el sustrato de células distancias son bastante constante para U251-MG de control y las células de tipo salvaje con los valores típicos de 80-100 nm (amarillo; Figura 4b ) y 150-200 nm (color naranja-rojo; Figura 4a).

Figura 1. Dispositivo de iluminación para VA-TIRFM en un microscopio vertical. Un espejo ajustable accionado por un motor paso a paso permite una resolución angular de ± 0,25 °.

Figura 2. Evaluación perfil para un pixel (esquemática). Cuando ln [I _F / T (Θ)] se representa gráficamente como una función de 1 / d (Θ), la pendiente representa la distancia Δ célula-sustrato. Esta pendiente se determina comúnmente con una precisión de aproximadamente ± 10%. Uno de los valores - como resultado de la iluminación no homogénea - ha estado marcada y excluidos de la evaluación.

Figura 3 imágenes TIRFM de U251-MG células de glioblastoma con activado gen supresor TP53 tras la incubación con laurdan (8 micras; 60 min). Grabado en varios ángulos de iluminación (CA); sustrato celular distancias en el intervalo de 0-600 nm mostrado por un código de color (d); longitud de onda de excitación: 391 nm, la detección: ≥ 420 nm, el tamaño de la imagen: 210 m. × 210 micras Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4-sustrato celular distancias de U251-MG células glioblatoma en el intervalo de 0-600 nm mostradas por un código de color;. (A) de tipo salvaje (b) los controles; (c) las células con el gen supresor TP53 activado; (d) células con PTEN activado gen supresor de longitud de onda; excitación: 391 nm, la detección: ≥ 420 nm, el tamaño de la imagen: 210 m. × 210 micras Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Se describe un método para la medición de distancias en el sustrato de células con una precisión nanométrica. En la actualidad, los métodos de microscopia de super-resolución, por ejemplo, sobre la base de iluminación estructurada ⁷ o en un solo ^8-10 moléculas de detección, así como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía ¹¹ son de considerable interés. Ninguna de estas técnicas, sin embargo, permite una resolución axial por debajo de 50 nm. Además, la irradiación bastante alto de 50100 W / cm ² es necesario para métodos de una sola molécula y más de 3.000 ² W / cm para microscopía STED. Esto supera la irradiación solar (aproximadamente 100 mW / cm ²⁾ en varios órdenes de magnitud, para que el daño a las células vivas rápido es probable que ocurra. En VA-TIRFM experimentos, sin embargo, la irradiación se puede limitar a menos de 20 mW / cm ^2, lo que permite tiempos de exposición de varios minutos o incluso horas sin ningún daño a las células vivas ^12, de modo que los experimentos de larga duración con mulples exposiciones parecen estar bien posible. Requisitos principales para cada experimento son una buena calibración angular y la iluminación homogénea de diapositivas de objetos limpios.

VA-TIRFM se puede aplicar a numerosos temas relacionados con superficies técnicos o biológicos, por ejemplo, mediciones de la adhesión celular a un sustrato transparente. El crecimiento celular, la migración celular o la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) puede, por lo tanto, ser estudiado más en detalle. Recientemente, el papel del colesterol intracelular en la adhesión celular se examinó ^4. En particular, resultó que el número de contactos de sustrato celular se redujo al agotamiento de colesterol por 3050% y, finalmente conduce a desprendimiento de un mayor número de células a partir de su sustrato. La adhesión celular se estudió también en la aplicación de fotosensibilizantes de uso común en la terapia fotodinámica (PDT) de cáncer y otras enfermedades ^13. Resultó que tras la irradiación con no fototóxicas dosis de luz de sustrato celular distanciasSe redujo ligeramente (posiblemente debido a una cierta hinchazón de la célula), mientras que las adherencias focales fueron mantenidas ^4,5. Por lo tanto, la formación de metástasis debido a la PDT no era probable que se produzca. Presentes experimentos muestran diferencias de la adhesión celular entre tumor (glioblastoma) y células malignas menos. Sólo los futuros experimentos probar si este comportamiento diferente se puede utilizar para aplicaciones de diagnóstico, farmacológicos o terapéuticos.

Cabe destacar que las mediciones de los contactos célula-sustrato se remontan a principios de la microscopía TIRF ^14. Resolución angular, sin embargo, el equipo necesario bastante complejo ^15, hasta el momento, y solamente el desarrollo de un dispositivo de iluminación compacto para ángulo variable TIRFM ³ mediciones de rutina permitidos de topología célula-sustrato. Además de esto TIRFM tipo prisma, la miniaturización se introdujo por objetivo de tipo TIRFM ^16,17, donde un solo punto (o anillo) cerca del borde deel plano de apertura de la lente objetivo del microscopio se ilumina, de modo que la luz puede caer sobre la muestra bajo un ángulo Θ ≥ Θ _C. Por lo tanto, altas lentes de objetivo de abertura que permitan a un rango angular de aproximadamente 66-75 ° se necesitan. Sintonización del ángulo Θ, sin embargo, requiere un cambio definido del foco de láser a una distancia de menos de 100 micras, lo cual es difícil de realizar, incluso en un microscopio TIRFM comercializado. Otros inconvenientes de abertura alto (y de gran aumento) lentes objetivas son la anisotropía de campo cercano y campos de objetos bastante limitados. Por lo tanto, en comparación con el objetivo de tipo TIRFM configuraciones experimentales, como se describe en este manuscrito son preferibles para la medición de célula-sustrato topología.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera