Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Summary

Топология адгезии клеток на подложке измеряется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (VA-TIRFM).

Abstract

Топологию поверхности, например, клеток, растущих на подложке, определяется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM). Клетки культивируются на прозрачных слайдов и инкубировали с флуоресцентным маркером равномерно распределены в их плазматической мембраны. Освещение происходит путем параллельного пучка лазера при переменным углом полного внутреннего отражения (ПВО) с различной глубиной проникновения затухающих электромагнитных полей. Запись флуоресцентных изображений при облучении около 10 различных углов позволяет рассчитывать клетки с субстратом расстояния с точностью до нескольких нанометров. Различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковых клеток и менее злокачественных клеток, таким образом, определена. Кроме того, возможны изменения клеточной адгезии при химическом или фотодинамической терапии могут быть рассмотрены. По сравнению с другими методами супер-разрешение воздействия световой микроскопии сохраняетсяочень маленький, и без повреждения живых клеток, как ожидается, произойдет.

Introduction

Когда луч света, распространяющегося через среду с показателем преломления п ₁ соответствует интерфейс для второй среде с показателем преломления п ₂ <N _1, полное внутреннее отражение происходит на всех углах падения Θ, которая больше, чем критический угол Θ _с = агсзш (N ₂ / N _1). Несмотря на полное отражение падающего света вызывает затухающих электромагнитных полей, который проникает во вторую среду и убывает экспоненциально с перпендикулярной расстоянии г от интерфейса в соответствии с I (г) = I ^{_{0-эз / D (Θ).}} Я (г) соответствует интенсивности электромагнитного поля и D (Θ) с глубиной проникновения на длине волны λ, определяемый

D (Θ) = (λ/4π) (п ₁ ² грехов ² Θ – N _{² 2)} ^{-1 / 2}

Как сообщалось в литературе, ^1,2, I ₀ </sUB> соответствует интенсивности падающего света I _{электронной} умножается на коэффициент пропускания T (Θ) и соотношение N ₂ / N _1. Если вектор напряженности электрического поля этой световой луч поляризован перпендикулярно плоскости падения (т.е. плоскости, натянутой на падающий и отраженный луч), этот коэффициент передачи определяется

T (Θ) = 4 соз ² Θ / [1 – (N ₂ / NL ₁₎ ^2]

Для обнаружены интенсивности флуоресценции в TIRFM измерений, поглощение света должно быть интегрировано над всеми слоями образца и умножается на квантовый выход флуоресценции η соответствующих красителей, а также с твердым угол обнаружения Ω. Как сообщалось ранее ^3, эта интенсивность может быть описан

Я _F (Θ) = AT (Θ) ° С (г) ^{е-Z / D (Θ)} йг

если все факторы, которые не зависят F ROM от угла падения Θ и координаты г, включены в экспериментальную постоянной Уравнение A. 3 может быть решена аналитически, если концентрация с (г) флуорофоров они считаются почти постоянной

– Либо вообще координат г ≥ Δ, например, в цитоплазме клетки, имеющие расстояние Δ от интерфейса. В этом случае интеграл должен быть рассчитана г = Δ для г = ∞ в результате

I _F = C T (Θ) D (Θ) ^{E-Δ / D (Θ)}

– Или между г = Δ – т / 2 и Z = Δ + т / 2, т. е. в тонком слое толщиной т, например, клеточные мембраны расположены на расстоянии Δ от интерфейса. В этом случае интенсивность флуоресценции может быть рассчитана как

I _F = C T (Θ) ^{тэ-Δ / D (Θ),}

Если Т мала по сравнению с Δ.

ENT "> Из уравнений (4) и (5) клетки с субстратом расстояния Δ может быть рассчитана, если изображение интенсивности флуоресценции I _F записываются для переменными углами Θ, а если п (I _F / T г) (уравнение 4) или п (I _F / T) (формула 5) вычисляется как функция 1 / сут в течение этих углов. Для мембранных маркеров лаурдана используемые в этой статье (ст. ниже) оценка была выполнена в соответствии с формулой. 5.

Как сообщалось ранее ^3, получения изображений и оценки требуется
– Равномерное распределение света возбуждения по образцу,
– Срок действия 2-х слойной модели (с показателями преломления N ₁ и N ₂ к подложке и цитоплазмы, соответственно). Это справедливо, если плазма мембрана очень тонкая, и если слой внеклеточной среде (между клеткой и подложкой) мала по сравнению с длиной волны падающего света.

Кроме того, умеренное числовой апертурой(Обычно ≤ 0,90) от объектива микроскопа выгодно, чтобы избежать отклонения яркости из-за анизотропии излучения в ближнем поле диэлектрик.

Protocol

1. Посев и инкубация клеток Семенной отдельных клеток, например, U373-MG или U-251-MG клетки глиобластомы при типичной плотностью 100 клеток / мм 2 на предметное стекло и выращивать их для 4872 часов в культуральной среде (например, RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей …

Discussion

Описан метод измерения клетки с субстратом расстояния с нанометровой точностью. В настоящее время методы супер-разрешение микроскопа, например, на основе структурированной подсветки ⁷ или на одну молекулу обнаружения ^8-10, а также вынужденное излучение истощения (STED) ми…

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera