Nanotopology af celleadhæsion ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Summary

Topologi af celleadhæsion på et substrat måles med nanometer præcision ved variabel vinkel total intern refleksion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM).

Abstract

Overflade topologi, fx af celler, der vokser på et substrat, bestemmes med nanometer præcision ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). Cellerne dyrkes på gennemsigtige objektglas og inkuberet med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembran. Belysning sker ved en parallel laserstråle under variable vinkler af total indre refleksion (TIR) ​​med forskellige indtrængningsdybder af det rumligt dæmpede elektromagnetiske felt. Optagelse af fluorescensbilleder ved bestråling ved omkring 10 forskellige vinkler tillader at beregne celle-substrat-afstande med en præcision på nogle få nanometer. Forskelle i adhæsion mellem forskellige cellelinier, fx cancerceller og mindre maligne celler, bestemmes således. Endvidere kan eventuelle ændringer i celleadhæsion ved kemisk eller fotodynamisk behandling undersøges. I sammenligning med andre metoder til super-opløsning mikroskopi lys eksponering holdesmeget lille, og ingen beskadigelse af levende celler forventes at forekomme.

Introduction

Når en lysstråle udbreder sig gennem et medium med brydningsindex n ₁ møder en grænseflade til et andet medium af brydningsindeks _{n2 <n1,} total intern refleksion forekommer i alle indfaldsvinkler Θ, som er større end den kritiske vinkel Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Trods bliver totalt reflekteret den indfaldende lysstråle fremkalder en rumligt dæmpede elektromagnetiske felt, der trænger ind i det andet medium og henfalder eksponentielt med vinkelrette afstand z fra grænsefladen ifølge I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) svarer til intensiteten af ​​det elektromagnetiske felt og d (Θ) til indtrængningsdybden ved bølgelængden λ, som givet ved

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ – n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

Som rapporteret i litteraturen ^1,2, I ₀ </sub> svarer til intensiteten af indfaldende lys I _e ganget med transmissionen faktor T (Θ) og forholdet n ₂ / n _1. Hvis det elektriske felt vektor af denne lysstråle er polariseret vinkelret på planet af forekomsten (dvs. planet udspændt af den indfaldende og den reflekterede stråle), er denne transmissionsfaktor givet ved

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (N ₂ / nL ₁₎ ^2]

For den detekterede fluorescens-intensitet i TIRFM målinger, har lysabsorption, der skal integreres over alle lag i prøven og multipliceret med fluorescens kvantumudbytte η af den pågældende farvestof og med topvinklen i detektion Ω. Som rapporteret tidligere ^3, kan denne intensitet blive beskrevet ved

I _F (Θ) = AT (Θ) nOC (Z) ^{e-z / d (Θ)} dz

hvis alle de faktorer, der er uafhængige f rom indfaldsvinklen Θ og koordinat z er indbefattet inden for eksperimentel konstant A. Ligning 3 kan løses analytisk, hvis koncentrationen c (z) af fluoroforer anses for at være næsten konstant

– Enten overhovedet koordinaterne z ≥ Δ, fx i cytoplasmaet af celler med en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde har integralet skal beregnes ud fra z = Δ til z = ∞ resulterer i

Jeg _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– Eller mellem z = Δ – t / 2 og z = Δ + t / 2, dvs i et tyndt lag af tykkelsen t, fx en cellemembran beliggende i en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde kan fluorescensintensiteten beregnes som

Jeg _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

hvis t er lille i sammenligning med Δ.

ent "> Fra ligningerne (4) og (5) celle-substrat-afstande Δ kan beregnes, hvis billeder af fluorescensintensitet I _F registreres for variable vinkler Θ, og hvis ln (I _F / T d) (ligning 4) eller ln (I _F / T) (ligning 5) vurderes som funktion af 1 / d for disse vinkler. For membranen markør laurdan anvendes i dette dokument (s, nedenfor) evalueringen blev udført ifølge ligning. fem.

Som rapporteret tidligere ^3, image erhvervelse og evaluering kræver
– Homogen fordeling af excitationslyset over prøven,
– Gyldigheden af en 2-lags model (med brydningsindekserne n ₁ og _N2 i substratet og cytoplasmaet, henholdsvis). Dette gælder, når plasmamembranen er meget tynd, og hvis laget af det ekstracellulære medium (mellem cellen og substratet) er lille i forhold til bølgelængden for det indfaldende lys.

Endvidere kan en moderat numerisk apertur(Typisk A ≤ 0,90) af mikroskopet objektivlinsen er fordelagtigt at undgå afvigelser i lysstyrken på grund af anisotropi af stråling i den nærmeste område af det dielektriske grænseflade.

Protocol

1. Podning og inkubation af celler Seed individuelle celler, fx U373-MG eller U-251-MG glioblastoma-celler med en typisk densitet på 100 celler / mm 2 på et objektglas og dyrke dem i 4872 timer i dyrkningsmedium (fx RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum og antibiotika) ved anvendelse af en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Cellerne inkuberes med en membran markør, fx 6-dodecanoyl-2-dimethylamino-naphthalen (laurdan) påført i 60 minutter v…

Discussion

Der beskrives en fremgangsmåde til måling af celle-substrat-afstande med nanometer præcision. I øjeblikket metoder til super-opløsning mikroskopi, fx baseret på struktureret belysning ⁷ eller på enkelt molekyle detektion ^8-10 samt stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi ¹¹ er af betydelig interesse. Ingen af ​​disse teknikker er imidlertid, tillader en aksial opløsning under 50 nm. Desuden W / cm ² ret høj bestråling på 50.100 er nødvendig for …

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera