Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).
Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.
Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium brekingsindex n1 een interface aan een tweede medium brekingsindex n2 <n 1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte bij golflengte λ, zoals gegeven door
d (Θ) = (λ/4π) (1 2 n sin 2 Θ – 2 2 n) -1 / 2
Zoals gemeld in de literatuur 1,2, I 0 </sub> overeenkomt met de intensiteit van invallend licht I e vermenigvuldigd met de transmissiefactor T (Θ) en de verhouding n 2 / n 1. Indien het elektrisch veld vector van deze lichtbundel gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval (de vlak opgespannen door de invallende en de gereflecteerde bundel) bevindt het transmissiecoëfficiënt van de
T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 – (n 2 / nL 1) 2]
Voor de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit in TIRFM metingen lichtabsorptie te worden geïntegreerd over alle lagen van het monster en vermenigvuldigd met de fluorescentie quantum opbrengst η van de desbetreffende kleurstof als de ruimtehoek van detectie Ω. Zoals eerder 3, kan deze intensiteit worden beschreven
Ik F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz
als alle factoren die onafhankelijk zijn f rom de invalshoek Θ en z de coördinaat vallen binnen de experimentele constant A. Vergelijking 3 kan analytisch opgelost als de concentratie c (z) van fluoroforen wordt beschouwd als bijna constant
– Op alle coördinaten z ≥ Δ, bijvoorbeeld in het cytoplasma van cellen met een afstand Δ van de interface. In dit geval integraal moet worden berekend z = Δ z = ∞ tot gevolg
Ik F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ)
– Tussen z = Δ – t / 2 en z = Δ + T / 2, dat wil zeggen in een dunne laag van dikte t, bijvoorbeeld een celmembraan op een afstand Δ van de interface. In dit geval kan de fluorescentie intensiteit berekend als
Ik F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ),
Als t klein in vergelijking met Δ.
Zoals eerder gerapporteerd 3, beeldacquisitie en evaluatie vereist
– Een homogene verdeling van excitatie licht op het monster,
– Geldigheid van een 2-laags model (de brekingsindices n 1 en n 2 voor het substraat en het cytoplasma, respectievelijk). Dit geldt als de plasmamembraan is zeer dun, en indien de laag van het extracellulaire medium (tussen de cel en het substraat) klein is vergeleken met de golflengte van invallend licht.
Bovendien een matige numerieke apertuur(Meestal A ≤ 0,90) van de microscoop objectieflens voordeel zijn wanneer afwijkingen van helderheid door anisotropie van straling in het nabije veld van de diëlektrische interface.
Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting 7 of op single molecule detectie 8 tot 10 en stimulated emission depletion (STED) microscopie 11 zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm 2 nodig voor enkel m…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de deelstaat Baden-Württemberg en de Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung – voor de financiering van ZAFH-foton n, het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) voor de financiering van onderzoek subsidie niet. 1792C08 evenals de deelstaat Baden-Württemberg-Stiftung GmbH voor de financiering van het project "Aurami".
Name | Company | Type | Comments |
Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |