Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

Summary

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Abstract

טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) ​​עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של ​​תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.

Introduction

כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N ₁ שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n _{2 <1} n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ _ג = arcsin (n ₂ / n _1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = ₀ אני ^{_{ez / ד (Θ).}} אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי

ד (Θ) = (λ/4π) ₍₁ ² חטא n ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

כפי שדווח בספרות ^1,2, אני ₀ שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n ₂ / n _1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (n ₂ / NL ₁₎ ^2]

לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה ​​עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר ^3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי

אני _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{דואר z / ד (Θ)} dz

אם כל הגורמים שהם f עצמאי rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע

- או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך

אני _F = ג T (Θ) ד (Θ) ^{דואר Δ / ד (Θ)}

- או בין z = Δ - t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ

אני _F = ג T (Θ) ^{טה-Δ / ד (Θ),}

אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ.

> "אף אוזן גרון ממשוואות (4) ו (5) מרחקי תא מצע Δ ניתן לחשב, אם תמונות של עוצמת קרינה אני _F נרשמים לזוויות משתנות Θ, ואם ln (אני _F / T ד) (Eq. 4) או ln (אני _F / T) (Eq. 5) מוערך כפונקציה של 1 / ד לזוויות אלה. לקרום סמן laurdan השתמש בנייר הזה (סעיף להלן) ההערכה בוצעה על פי משוואה. 5.

כפי שדווח בעבר ^3, תמונת רכישה וההערכה דורשת
- הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם,
- תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n ₁ ו n ₂ למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע.

בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.

Protocol

1. זריעה ודגירה של תאים

1. תאי זרע בודד, למשל U373-MG או תאי glioblastoma U-251-MG בצפיפות אופיינית של 100 תאים / מ"מ ² בשקופית זכוכית ולגדל אותם לשעת 4872 במדיום התרבות (למשל RPMI 1640 בתוספת 10% עגל בסרום עוברי ואנטיביוטיקה) באמצעות חממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. דגירת תאים עם סמן קרום, למשל 6-dodecanoyl-2-dimethylamino הנפטלין (laurdan) הגיש בקשה ל60 דקות בריכוז של 8 מיקרומטר (בתרבות בינונית) ^4, או סמן ציטופלסמה, למשל calcein acetomethlyester בקש 40 דקות ב ריכוז של 5 מיקרומטר ^3, או קרום הקשור פוטוסנסיטייזר, למשל protoporphyrin תשיעי מושרה על 4 שעתי דגירה למבשרה חומצה 5-aminolevulinic (5-ALA; 1 מ"מ) ^4,5.
3. לשטוף את התאים עם מדיום תרבות או נאגר מלוח פוספט (PBS) לפני מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. השתמש במיקרוסקופ זקוף, למשל Zeiss Axioplan, ולהחליף את קבלו על ידי מכשיר תאורה, כמתואר במס. 3 עם hemi-כדורי או הפריזמה זכוכית חמה גלילים יחד אופטי לשקופית האובייקט (ראה תרשים 1).
2. השתמש בקרן ליזר collimated מקבילה הלאחר הדמיה על ידי פריזמה הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים (למשל קעור מראה) שוב תוצאות בקורה מקביל על פני השטח של המדגם (ריי התלמיד telecentric). תשמרו על עצמך שוקטור השדה החשמלי הוא מאונך למישור קיטוב של שכיחות.
3. השתמש במראת מתכוונן ממוקמת בתוך הקבל שצלם במטוס המדגם ומאיר את המדגם תחת זווית משתנה של שכיחות (קרן אובייקט). המראה מתכווננת עשוי להיות מונע על ידי מנוע צעד, כאשר כל תנוחה מתאימה לזווית מוגדרת היטב של מקרים, כפי שנקבע על ידי מדידות goniometric ³
4. כייל את העמדה זוויתי של המראה מתכווננת באמצעות זווית הקריטית Θ _c = 61.3 ° למעבר זכוכית במים כערך קבוע. Θ _ג ניתן דמיין על וריאציה של Θ כאשר צבע פלואורסצנטי (1 mononucleotide למשל mM פלבין, FMN) מומס במים. עמדתו של הראי בΘ = Θ _ג מאוחסן בתכנית מיצוב המראה.
5. הגדר את הפרמטרים של המצלמה (מואר בחזרה תידור iXon EMCCD, DV887DC, יידור טכנולוגיה, בלפסט, ^{6 בבריטניה),} כולל טמפרטורה, רווח, זמן הקלטה ומהירות משמרת.
6. השתמש בעדשת מטרת ההגדלה המתאימה וצמצם מספרי מעדיף מתון (למשל 40 × / 0.75 או 63 × / 0.90 טבילה במים) ולמקם את האובייקט בשקופית מיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה כדי להבטיח מגע אופטי של המדגם עם פריזמה הזכוכית. להקליט תמונות פלואורסצנציה של דגימות זהות על וריאציה שלזווית של תאורה (Θ ≥ Θ Θ עם _{ג ג} המקביל ל64.5 ° לממשק תא זכוכית). טווח זוויתי של 66 ° -74 ° בצעדים של 0.5 מעלות או ° 1 מומלץ. השתמש מסירה ארוך מתאים או מסנן מעביר פס לגילוי קרינה.

3. ניתוח נתונים

1. קראו את התמונות (למשל בפורמט ASCII) נרשמו בזוויות שונות Θ, כמו גם את הגדרות המצלמה (לאפלית רקע), אורך גל העירור והמדדים השבירים לזכוכית ₍₁ n = 1.52) ותאים (n ₂ = 1.37) לתכנית ההערכה (LabVIEW; NanoCell). עבור כל קבוצה של פרמטרים החדירים לעומק ד (Θ) והעברת הגורם T (Θ) מחושבת באופן אוטומטי.
2. בחר תמונות המשמשות להערכת מרחקי תא מצע Δ פי משוואה 5 (סמן קרום) או משוואה 4 (סמן ציטופלסמה), תמונות בודדות עם הומוגניותתאורה (ה החושפנית, g. פסים) יכולה להיות שלילית.
3. חישוב תמונות של טופולוגיה תאי מצע ובחירת קוד צבע מתאים לתצוגה. במהלך פרופילי הערכה של פיקסלים בודדים יכול להיות מוצג, כמתואר באיור 2. פרופילים אלה יכולים לשמש כמדד לאיכות המתאימה.
4. אחסן את פרוטוקול ההערכה.

4. נציג תוצאות

ניסויים יציגים מבוצעים עם תאי U251-MG glioblastoma מהונדס גנטי שסופקו באדיבות על ידי פרופ 'Mollenhauer ינואר, מחלקה לאונקולוגיה המולקולרית, אוניברסיטת הדרום דנמרק, אודנסה. בשתי subclones של U251 תאים אלה גני מדכאי סרטן TP53 או PTEN נמצאים ביטוי יתר באמצעות ט במערכת ביטוי מושרה, כך שתאים אלה מפגינים פוטנציאל סרטני מופחת ויכולים להיחשב כפחות ממאיר. תאי U251-MG מאוד ממאירים ללא גן מדכא משמשים כקבוצת ביקורת, וU251-תאים מסוג בר MG לשמש להשוואה נוספת. דיודת ליזר פולטת סדרה רצופה של מעין פולסים picosecond (LDH400 עם הנהג PDL 800-B, Picoquant, ברלין, גרמניה; גל: 391 ננומטר; דופק אנרגיה: 12 PJ; שיעור החזרה: 40 מגה רץ) משמשת כמקור עירור.

באיור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גני מדכאי גידול TP53 פעילים ודגר עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות) מתוארות על זוויות של שכיחות של 66.0 מעלות, 69.0 ° 73.0 ° ומתאימות לעומק חדירה של שדה חלוף האלקטרומגנטי של כ 140 ננומטר, 75 ננומטר, 60 ננומטר, בהתאמה. עם ירידת פלואורסצנטי עומק החדירה יורד בעצמה (ראה קשקשים) ומקורו באתרים שטחיים יותר של התאים (אנשי קשר מוקד למשל בקצותיהם). מרחקי תאי מצע (דמיין ב3d איור על ידי קוד צבע החל 0-600 ננומטר) בחריפות משתנים על פני התאים בין עלly ננומטרים ספורים (לבן, צהוב) ו250-300 ננומטר (אדום כהה), אנשי קשר כלומר מוקד ומרחקים גדולים יותר תאי מצע הם באזור קרוב. והוא הדין לU251-MG תאי glioblastoma עם מדכאי גן PTEN פעיל (האיור 4D), ואילו מרחקי תא מצע הם די קבועים לבקרת U251-MG ותאים מסוג פראי עם ערכים אופייניים של 80-100 ננומטר (צהוב; האיור 4b ) ו150-200 ננומטר (כתום אדום; איור 4 א).

איור 1. מכשיר תאורה לVA-TIRFM במיקרוסקופ זקוף. מראה מתכווננת מונע על ידי מנוע צעד מאפשר רזולוציה הזוויתית של ± 0.25 °.

איור 2. פרופיל הערכה לאחד pix אל (סכמטי). כאשר ln [אני _F / T (Θ)] זמם כפונקציה של 1 / ד (Θ), השיפוע מייצג את תאי מצע מרחק Δ. מדרון זה נקבע בדרך כלל עם דיוק של כ 10% ±. ערך אחד - כתוצאה מתאורה לא הומוגנית - סומן ולא נכלל בהערכה.

איור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גן מדכא פעיל TP53 על דגירה עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות). נרשם בזוויות שונות של תאורה (AC); מרחקי תא מצע בטווח של 0-600 ננומטר הראה לפי קוד צבע (ד); אורך גל עירור: 391 ננומטר, זיהוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

ogether.within עמודים = "תמיד">
איור 4 מרחקי Cell-מצע של U251-MG תאי glioblatoma בטווח של 0-600 ננומטר מוצג על ידי קוד צבע;. (א) סוג פרוע (ב) פקדים: (ג) תאים עם גן מדכא פעיל TP53, (ד) תאים עם PTEN גן המדכא הופעל; גל עירור: 391 ננומטר, גילוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית ⁷ או במולקולה בודדה ^8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה ¹¹ הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו, עם זאת, מאפשר רזולוציה צירית להלן 50 ננומטר. בנוסף, קרינה גבוהה למדי של 50100 W / ² סנטימטר נחוץ לשיטות מולקולה בודדות ויותר מ 3000 W / ² סנטימטר למיקרוסקופיה STED. זה חורג מקרינת שמש (כ 100 / סנטימטר mW ²⁾ בכמה סדרי גודל, כך שהניזק המהיר לתאי חיים עשוי להתרחש. בניסויי VA-TIRFM, לעומת זאת, קרינה יכולה להיות מוגבלת פחות מ 20 mW / ² סנטימטר, ומאפשרת זמני חשיפה של כמה דקות או אפילו שעות, בלי לגרום ניזק לתאי חי ^12, כך שניסויים ארוכי טווח עם מולאטיחשיפות טייפל מופיעות גם אפשריות. תנאים מוקדמים עיקריים לכל ניסוי הם כיול זוויתי טוב ותאורה הומוגנית של שקופיות אובייקט נקיות.

VA-TIRFM יכול להיות מיושם על נושאים רבים הקשורים למשטחים טכניים או ביולוגיים, מדידות לדוגמה של הידבקות תא למצע שקוף. גדילת תאים, נדידת תאים ומות תאים (אפופטוזיס לדוגמה) יכולה, אם כן, ניתן ללמוד יותר בפירוט. לאחרונה, את תפקידו של כולסטרול תאי על הידבקות תא נבדק ^4. בפרט, התברר כי מספר אנשי קשר תא מצע הופחת על דלדול של כולסטרול על ידי 3050%, ולבסוף הוביל לניתוק של מספר גדול יותר של תאים מהמצע שלהם. הידבקות תא הייתה גם למד על יישום של פוטוסנסיטייזרים הנפוץ בטיפול פוטודינמי (PDT) של סרטן ומחלות אחרות ^13. התבררתי כי עם הקרנה עם מינוני מרחקי האור הלא phototoxic תא מצעהופחתו מעט (אולי בשל נפיחות מסוימת של התא), ואילו הידבקויות מוקד נשמרו ^4,5. לכן, ההיווצרות של גרורות בשל PDT לא הייתה סבירה שיתרחש. ניסויים נוכחיים מראים הבדלים של הידבקות תא בין גידול (glioblastoma) ותאים ממאירים פחות. רק הניסויים באים יוכיחו אם התנהגות שונה זה יכול לשמש ליישומים אבחוניים, תרופתיים או טיפוליים.

יודגש כי מדידות של אנשי קשר של תא מצע תאריך חזרה לתחילת מיקרוסקופיה TIRF ^14. רזולוציה זוויתי, לעומת זאת, נדרשה ציוד מורכב למדי ^15, עד כה, ורק פיתוח של מכשיר תאורה קומפקטית לTIRFM ³ מדידות משתנות זווית מותרית שגרתיות של טופולוגיה תא מצע. בנוסף לזה TIRFM מנסרת סוג, מזעור הוצג על ידי TIRFM אובייקטיבי הסוג ^16,17, שם נקודה אחת (או annulus) קרובה לקצהמטוס הצמצם של עדשת המיקרוסקופ האובייקטיבי מואר, כך שהאור יכול לנפול על המדגם תחת זווית Θ ≥ Θ _C. לכן, אובייקטיבי עדשות צמצם גבוהות המאפשרות טווח הזוויתי של כ 66-75 מעלות יש צורך. כוונון של זווית Θ, לעומת זאת, דורש שינוי הגדרה של מוקד הליזר במרחק של פחות מ 100 מיקרומטר, שזה קשה לביצוע, ואפילו במיקרוסקופ TIRFM ממוסחר. חסרונות נוספים של צמצם גבוה (והגדלה גבוהה) עדשות אובייקטיביות הם אנאיזוטרופיה שדה ליד ושדות אובייקט ולא מוגבלים. לכן, בהשוואה למערכי ניסוי TIRFM אובייקטיבי מסוג שתואר בכתב יד זה הם עדיף למדידת טופולוגיה תא מצע.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera