Nanotopology av celladhesion vid rörlig Vinkel total inre reflektion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Summary

Topologi av celladhesion på ett substrat mäts med nanometer precision genom variabel vinkel total inre reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM).

Abstract

Yta topologi, t.ex. av celler som växer på ett substrat, bestäms med nanometer precision genom variabel-Vinkel total intern reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM). Celler odlas på transparenta objektglas och inkuberas med en fluorescerande markör homogent fördelade i deras plasmamembran. Belysning sker genom en parallell laserstråle under varierande vinklar av total intern reflektion (TIR) ​​med olika inträngningsdjup av det evanescenta elektromagnetiska fältet. Registrering av fluorescensbilder vid bestrålning vid ca 10 olika vinklar medger att beräkna cell-substrat avstånd med en precision av några nanometer. Skillnader i vidhäftning mellan olika cellinjer, t.ex. cancerceller och mindre maligna celler, är sålunda bestämda. Dessutom, kan eventuella förändringar av celladhesion vid kemisk eller fotodynamisk behandling undersökas. I jämförelse med andra metoder för super-upplösning mikroskopi ljusexponering hållsmycket liten, och ingen skada av levande celler förväntas ske.

Introduction

När en ljusstråle som utbreder sig genom ett medium av brytningsindex n ₁ möter ett gränssnitt till ett andra medium med brytningsindex n ₂ <n _1, sker total inre reflektion vid alla infallsvinklar Θ, som är större än den kritiska vinkeln Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Trots att totalreflekteras den infallande ljusstrålen framkallar ett evanescent elektromagnetiskt fält som tränger in i den andra mediet och sönderfaller exponentiellt med vinkelräta avståndet z från gränsytan enligt I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) motsvarar intensiteten hos det elektromagnetiska fältet och d (Θ) till inträngningsdjupet vid våglängden λ, som ges av

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ – n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

Som rapporterats i litteraturen ^1,2, ₀ jag </sub> motsvarar intensiteten hos infallande ljus jag _e multiplicerat med transmissionen faktor T (Θ) och förhållandet N ₂ / N _1. Om den elektriska fältvektorn av denna ljusstråle är polariserat vinkelrätt mot infallsplanet (dvs. planet överbryggas av den infallande och den reflekterade strålen), är denna överföring faktor ges av

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (N ₂ / nL ₁₎ ^2]

För den detekterade fluorescensintensiteten i TIRFM mätningar, måste Ijusabsorption ska integreras över alla skikten i provet och multipliceras med fluorescens kvantutbytet η av den relevanta färgämnet liksom med den fasta vinkeln för detektering Ω. Som tidigare rapporterats ^3, kan denna intensitet beskrivas genom

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

om alla faktorer som är oberoende f rom infallsvinkeln Θ och koordinaten z ingår i den experimentella konstanta A. Ekvation 3 kan lösas analytiskt, om koncentrationen C (Z) av fluoroforer anses vara nästan konstant

– Antingen vid alla koordinater z ≥ Δ, t.ex. inom cytoplasman i celler som har ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, måste integralen beräknas från z = Δ till z = ∞ resulterar i

I _F = A K T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

– Eller mellan z = Δ – t / 2 och z = Δ + t / 2, dvs inom ett tunt skikt av tjocklek t, t.ex. ett cellmembran belägen på ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, kan fluorescensintensiteten beräknas som

I _F = A K T (Θ) ^{TE-Δ / d (Θ)}

Om t är liten i jämförelse med Δ.

ENT "> Från ekvationerna (4) och (5) cell-substrat avstånd Δ kan beräknas, om bilder av fluorescensintensitet I _F registreras för variabla vinklar Θ och om ln (I _F / T d) (Ekv. 4) eller ln (I _F / T) (Ekv. 5) utvärderas som en funktion av 1 / d för dessa vinklar. För membran markören laurdan används i detta dokument (s. nedan) Utvärderingen utfördes enligt Ekv. 5.

Som tidigare rapporterats ^3, bild förvärv och utvärdering kräver
– Homogen fördelning av excitationsljus över provet,
– Giltigheten av en 2-lagers modell (med brytningsindex n ₁ och n ₂ för substratet och cytoplasman, respektive). Detta gäller, om plasmamembranet är mycket tunn, och om skiktet av det extracellulära mediet (mellan cellen och substratet) är liten jämfört med våglängden hos infallande ljus.

Dessutom, en måttlig numerisk apertur(Typiskt A ≤ 0,90) i mikroskopet objektiv är fördelaktigt att undvika avvikelser i ljusstyrka beroende på anisotropi av strålning i närområdet av den dielektriska gränssnittet.

Protocol

1. Sådd och inkubering av celler Seed individuella celler, t.ex. U373-MG eller U-251-MG-celler glioblastom vid en typisk densitet av 100 celler / mm 2 på en glasskiva och odla dem för 4872 timmar i odlingsmedium (t.ex. RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum och antibiotika) med användning av en inkubator vid 37 ° C och 5% COj 2. Inkubera cellerna med ett membran markör, t.ex. 6-dodekanoyl-2-dimetylamino-naftalen (laurdan) tillämpas fö…

Discussion

En metod beskrivs för att mäta cell-substrat avstånd med nanometer precision. För närvarande metoder för super-upplösning mikroskopi, t.ex. baserade på strukturerade belysningen ⁷ eller på enstaka molekyl upptäckt ^8-10 samt stimulerad emission utarmning (Sted) mikroskopi ¹¹ är av stort intresse. Ingen av dessa tekniker tillåter emellertid en axiell upplösning under 50 nm. Dessutom W / cm ² ganska hög irradians av 50.100 behövs för enda molekyl metoder …

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera